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【摘要】 目的：探讨柴胡皂苷对抑郁模型大鼠行为及海马神经元细胞凋亡的保护作用。方法：采用随机数字表法将60只SD雄性大鼠分为对照组、模型组、氟西汀组和柴胡皂苷组，每组15只。采用慢性不可预见性应激刺激（CUMS）加孤养方式复制抑郁模型。于造模第2天开始，对氟西汀组和柴胡皂苷组大鼠进行灌胃给药。在实验的第1、7、14、21天，通过糖水消耗量实验检测大鼠行为学改变。采用RT-PCR法对各组大鼠脑海马神经元JNK、Bad mRNA进行定量分析。结果：对照组、柴胡皂苷组、氟西汀组第14及21天糖水偏爱度均高于模型组，JNK、Bad mRNA表达量均低于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：柴胡皂苷可以有效控制大鼠抑郁症状，其机制可能与降低海马组织中JNK、Bad蛋白表达有关。
【关键词】 柴胡皂苷； 海马； 抑郁； 凋亡信号调节激酶1
抑郁症的发病机制目前有多种假说，有观点认为抑郁易损基因与心理应激的共同作用，导致的氧化应激、神经元凋亡与抑郁症的发生密切相关[1]。基于寻找抗抑郁作用的靶治疗点，科学界开展了大量的研究，并取得一定的进展[2-3]。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，具有解郁醒脑、改善抑郁样症状的作用，但机制尚不明确。本实验从柴胡皂苷抗凋亡、缓解神经元损伤角度探讨其抗抑郁作用机制，现具体报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 2～3月龄清洁级雄性健康SD大鼠60只，体重180～200 g，由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。采用随机数字表法将其分为正常对照组、模型组、氟西汀组和柴胡皂苷组共四组，每组15只。
1.2 药品及试剂 柴胡皂苷（南京泽朗医药科技有限公司提供，批号：ZL043583DY），盐酸氟西汀胶囊（苏州俞氏药业有限公司。批号：H20093454），PCR试剂盒、反转录试剂盒由宝生物工程有限公司提供。
1.3 仪器 PCR System扩增仪2700为Applied Biosystems公司产品，荧光定量PCR仪ABI7300为ABI公司产品。
1.4 方法
1.4.1 造模及给药 对照组不给予任何刺激。其余各组大鼠均分笼饲养并进行21 d慢性不可预见性应激（CUMS）刺激，方法根据Katz法进行改进[4]。于造模第2天开始氟西汀组采用氟西汀1.2 mg/ （kg·d），柴胡皂苷组采用柴胡皂苷25 mg/ （kg·d）进行灌胃给药，对照组及模型组给予等量生理盐水。
1.4.2 大鼠行为学评价 在实验的第1、7、14、21天测定1 h大鼠饮用1%蔗糖水及纯水量，计算大鼠糖水偏爱度（糖水偏爱度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%）。
1.4.3 RT-PCR法检测JNK、Bad的mRNA含量 分离海马，按RNAiso Reagent试剂盒操作流程提取海马组织总RNA并测验RNA纯度及浓度。按照SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）kit试剂盒说明进行实验，反应体系为25 ?L。反应引物：JNK-F1：5’-CTGTGCTAATGACCTGCTTGTTG-3’，JNK-R1：5’-TACCCGAGAGTTTGGGCTGT-3’，Bad-F1：5’-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3’，Bad-R1：5’-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3’，按下列公式计算△△Ct值：△CT（test）=CT（target，test）-CT（ref，test），△CT（calibritor）=CT（target，cal）-CT（ref，cal），△△CT=△CT（test）-CT（calibritor），各样品mRNA表达水平均用2-△△CT表示。
1.5 统计学处理 运用SPSS 13.0软件包对所得数据进行统计学处理，计量数据使用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验法，以P<0.05为差异有统计学有意义。
2 结果
2.1 大鼠行为学评价 对照组、柴胡皂苷组、氟西汀组第14及21天糖水偏爱度均高于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.2 柴胡皂苷对大鼠海马JNK、Bad mRNA表达的影响 对照组、柴胡皂苷组、氟西汀组JNK、Bad mRNA表达量均低于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），见表2。
3 讨论
随生活环境改变，影响人类健康的心境疾病逐年增多，其中尤以抑郁症为著，为探讨抗抑郁新药国内外科研团队开展了多年的研究[4-5]。抑郁症的机制复杂，根治不彻底是现今医疗界的难题[6]。本实验采用孤养结合CUMS复制大鼠抑郁模型，探讨柴胡皂苷的抗抑郁作用。
本实验采用糖水消耗量检测评价大鼠抑郁程度。随造模时间增加，大鼠抑郁样症状加重，糖水偏爱度减少证实其快感缺失严重。通过糖水消耗实验证实本实验成功复制大鼠抑郁模型。
JNK属于细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族的成员[8]。JNK蛋白可被紫外线照射、炎性因子等多种凋亡刺激所激活[9-10]。激活的JNK又可导致下游级联反应，促进神经元凋亡。JNK激活后可通过两条途径发挥作用：一是上调促凋亡相关蛋白的表达从而激活死亡受体凋亡通路，另一条途径是通过调节Bcl-2家族成员的活性参与线粒体介导的细胞凋亡通路。
凋亡蛋白Bad是Bcl-2家族成员之一。Bad在外周及中枢神经元、淋巴细胞、生殖细胞及许多上皮细胞中均有表达[11-12]。Bad在凋亡刺激信号作用于促凋亡成员时发生构型改变，易位并插入线粒体外膜发挥促凋亡活性[13]。 综上所述，本研究采用慢性不可预见性应激刺激结合孤养，成功建立抑郁大鼠模型，主要表现为糖水消耗量减少。本实验通过柴胡皂苷与氟西汀对抑郁大鼠进行灌胃给药后，大鼠海马神经元中JNK蛋白表达明显降低，其下游蛋白亦发生级联反应，Bad蛋白呈现低表达。说明柴胡皂苷可能通过抑制海马神经元JNK蛋白表达，下调Bad蛋白表达，从而减少神经细胞凋亡。
目前抑郁症的病理机理尚不完全明确[14-15]。但结合大鼠糖水消耗量的改善，可以证实，柴胡皂苷抗抑郁作用明显，其抗抑郁作用的机制可能与降低大鼠海马组织中的JNK、Bad蛋白表达有关。
参考文献
[1]钟静玫，郭强，武绍远，等.抑郁症与氧化应激[J].中华行为医学与脑科学杂志，2011，20（7）：665-666.
[2]樊蔚虹，姚建平，杨清，等.柴胡疏肝散干预卒中后抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的机制研究[J]中国实验方剂学杂志，2011，17（22）：216-218.
[3] Wester J C，Contreras D.Differential modulation of spontaneous and evoked thalamocortical network activity by acetylcholine level in vitro[J].The Journal of Neuroscience，2013，33（45）：17 951-17 966.
[4] Han D，Wang E C.Remission from depression：a review of venlafaxine clinical and economic evidence[J].Pharmacoeconomics，2005，23（6）：567-581.
[5] Wu J J，Bennett A M.Essential role for mitogen-activated protein（MAP）kinase phosphatase-1 in stress-responsive MAP kinase and cell survival signaling[J].J Biol Chem，2005，280（16）：16 461-16 466.
[6] Porter R J，Bowie C R，Jordan J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression：a rationale，review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.
[7]张晓杰，董海影，孙玉荣，等.柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马CA3区神经元的影响[J].时珍国医国药，2011，22（1）：43-45.
[8]张微.蛋白激酶D在H2O2介导的ASK1-JNK信号传导通路中的作用及其机制研究[D].杭州：浙江大学，2007.
[9] Zhang J，Bowden G T.Activation of p38 MAP kinase and JNK pathways by UVA irradiation[J].Photochem Photobiol Sci，2012，11（1）：54-61.
[10] Lisanti M P，Tsirigos A，Pavlides S，et al.JNK1 stress signaling is hyper-activated in high breast density and the tumor stroma：connecting fibrosis，inflammation，and stemness for cancer prevention[J].Cell Cycle，2014，13（4）：580-599.
[11] Cieslak D，Lazou A.Regulation of BAD protein by PKA，PKCdelta and phosphatases in adult rat cardiac myocytes subjected to oxidative stress[J].Mol Cells，2007，24（2）：224-231.
[12] Ohkubo N，Vitek M P，Morishima A，et al.Reelin signals survival through Src-family kinases that inactivate BAD activity[J].J Neurochem，2007，103（2）：820-830.
[13] Maiuri M C，Criollo A，Tasdemir E，et al.BH3-only proteins and BH3 mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X（L）[J].Autophagy，2007，3（4）：374-376.
[14]荣华，董海影，张静艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马CA3区超微结构的改变及脑组织ERK蛋白表达的影响[J].中国医学创新，2013，10（36）：10-12.
[15]金铭，蔡珍珍，董海影，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马组织及Bax、Bcl-2的影响[J].中国医学创新，2014，11（18）：36-38.
（收稿日期：2015-12-09） （本文编辑：王利）
【关键词】 柴胡皂苷； 海马； 抑郁； 凋亡信号调节激酶1
抑郁症的发病机制目前有多种假说，有观点认为抑郁易损基因与心理应激的共同作用，导致的氧化应激、神经元凋亡与抑郁症的发生密切相关[1]。基于寻找抗抑郁作用的靶治疗点，科学界开展了大量的研究，并取得一定的进展[2-3]。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，具有解郁醒脑、改善抑郁样症状的作用，但机制尚不明确。本实验从柴胡皂苷抗凋亡、缓解神经元损伤角度探讨其抗抑郁作用机制，现具体报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 2～3月龄清洁级雄性健康SD大鼠60只，体重180～200 g，由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。采用随机数字表法将其分为正常对照组、模型组、氟西汀组和柴胡皂苷组共四组，每组15只。
1.2 药品及试剂 柴胡皂苷（南京泽朗医药科技有限公司提供，批号：ZL043583DY），盐酸氟西汀胶囊（苏州俞氏药业有限公司。批号：H20093454），PCR试剂盒、反转录试剂盒由宝生物工程有限公司提供。
1.3 仪器 PCR System扩增仪2700为Applied Biosystems公司产品，荧光定量PCR仪ABI7300为ABI公司产品。
1.4 方法
1.4.1 造模及给药 对照组不给予任何刺激。其余各组大鼠均分笼饲养并进行21 d慢性不可预见性应激（CUMS）刺激，方法根据Katz法进行改进[4]。于造模第2天开始氟西汀组采用氟西汀1.2 mg/ （kg·d），柴胡皂苷组采用柴胡皂苷25 mg/ （kg·d）进行灌胃给药，对照组及模型组给予等量生理盐水。
1.4.2 大鼠行为学评价 在实验的第1、7、14、21天测定1 h大鼠饮用1%蔗糖水及纯水量，计算大鼠糖水偏爱度（糖水偏爱度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%）。
1.4.3 RT-PCR法检测JNK、Bad的mRNA含量 分离海马，按RNAiso Reagent试剂盒操作流程提取海马组织总RNA并测验RNA纯度及浓度。按照SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）kit试剂盒说明进行实验，反应体系为25 ?L。反应引物：JNK-F1：5’-CTGTGCTAATGACCTGCTTGTTG-3’，JNK-R1：5’-TACCCGAGAGTTTGGGCTGT-3’，Bad-F1：5’-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3’，Bad-R1：5’-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3’，按下列公式计算△△Ct值：△CT（test）=CT（target，test）-CT（ref，test），△CT（calibritor）=CT（target，cal）-CT（ref，cal），△△CT=△CT（test）-CT（calibritor），各样品mRNA表达水平均用2-△△CT表示。
1.5 统计学处理 运用SPSS 13.0软件包对所得数据进行统计学处理，计量数据使用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验法，以P<0.05为差异有统计学有意义。
2 结果
2.1 大鼠行为学评价 对照组、柴胡皂苷组、氟西汀组第14及21天糖水偏爱度均高于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.2 柴胡皂苷对大鼠海马JNK、Bad mRNA表达的影响 对照组、柴胡皂苷组、氟西汀组JNK、Bad mRNA表达量均低于模型组，比较差异均有统计学意义（P<0.01），见表2。
3 讨论
随生活环境改变，影响人类健康的心境疾病逐年增多，其中尤以抑郁症为著，为探讨抗抑郁新药国内外科研团队开展了多年的研究[4-5]。抑郁症的机制复杂，根治不彻底是现今医疗界的难题[6]。本实验采用孤养结合CUMS复制大鼠抑郁模型，探讨柴胡皂苷的抗抑郁作用。
本实验采用糖水消耗量检测评价大鼠抑郁程度。随造模时间增加，大鼠抑郁样症状加重，糖水偏爱度减少证实其快感缺失严重。通过糖水消耗实验证实本实验成功复制大鼠抑郁模型。
JNK属于细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族的成员[8]。JNK蛋白可被紫外线照射、炎性因子等多种凋亡刺激所激活[9-10]。激活的JNK又可导致下游级联反应，促进神经元凋亡。JNK激活后可通过两条途径发挥作用：一是上调促凋亡相关蛋白的表达从而激活死亡受体凋亡通路，另一条途径是通过调节Bcl-2家族成员的活性参与线粒体介导的细胞凋亡通路。
凋亡蛋白Bad是Bcl-2家族成员之一。Bad在外周及中枢神经元、淋巴细胞、生殖细胞及许多上皮细胞中均有表达[11-12]。Bad在凋亡刺激信号作用于促凋亡成员时发生构型改变，易位并插入线粒体外膜发挥促凋亡活性[13]。 综上所述，本研究采用慢性不可预见性应激刺激结合孤养，成功建立抑郁大鼠模型，主要表现为糖水消耗量减少。本实验通过柴胡皂苷与氟西汀对抑郁大鼠进行灌胃给药后，大鼠海马神经元中JNK蛋白表达明显降低，其下游蛋白亦发生级联反应，Bad蛋白呈现低表达。说明柴胡皂苷可能通过抑制海马神经元JNK蛋白表达，下调Bad蛋白表达，从而减少神经细胞凋亡。
目前抑郁症的病理机理尚不完全明确[14-15]。但结合大鼠糖水消耗量的改善，可以证实，柴胡皂苷抗抑郁作用明显，其抗抑郁作用的机制可能与降低大鼠海马组织中的JNK、Bad蛋白表达有关。
参考文献
[1]钟静玫，郭强，武绍远，等.抑郁症与氧化应激[J].中华行为医学与脑科学杂志，2011，20（7）：665-666.
[2]樊蔚虹，姚建平，杨清，等.柴胡疏肝散干预卒中后抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的机制研究[J]中国实验方剂学杂志，2011，17（22）：216-218.
[3] Wester J C，Contreras D.Differential modulation of spontaneous and evoked thalamocortical network activity by acetylcholine level in vitro[J].The Journal of Neuroscience，2013，33（45）：17 951-17 966.
[4] Han D，Wang E C.Remission from depression：a review of venlafaxine clinical and economic evidence[J].Pharmacoeconomics，2005，23（6）：567-581.
[5] Wu J J，Bennett A M.Essential role for mitogen-activated protein（MAP）kinase phosphatase-1 in stress-responsive MAP kinase and cell survival signaling[J].J Biol Chem，2005，280（16）：16 461-16 466.
[6] Porter R J，Bowie C R，Jordan J，et al.Cognitive remediation as a treatment for major depression：a rationale，review of evidence and recommendations for future research[J].Australian and New Zealand Journal of Psychiatry，2013，47（12）：1165-1175.
[7]张晓杰，董海影，孙玉荣，等.柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马CA3区神经元的影响[J].时珍国医国药，2011，22（1）：43-45.
[8]张微.蛋白激酶D在H2O2介导的ASK1-JNK信号传导通路中的作用及其机制研究[D].杭州：浙江大学，2007.
[9] Zhang J，Bowden G T.Activation of p38 MAP kinase and JNK pathways by UVA irradiation[J].Photochem Photobiol Sci，2012，11（1）：54-61.
[10] Lisanti M P，Tsirigos A，Pavlides S，et al.JNK1 stress signaling is hyper-activated in high breast density and the tumor stroma：connecting fibrosis，inflammation，and stemness for cancer prevention[J].Cell Cycle，2014，13（4）：580-599.
[11] Cieslak D，Lazou A.Regulation of BAD protein by PKA，PKCdelta and phosphatases in adult rat cardiac myocytes subjected to oxidative stress[J].Mol Cells，2007，24（2）：224-231.
[12] Ohkubo N，Vitek M P，Morishima A，et al.Reelin signals survival through Src-family kinases that inactivate BAD activity[J].J Neurochem，2007，103（2）：820-830.
[13] Maiuri M C，Criollo A，Tasdemir E，et al.BH3-only proteins and BH3 mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X（L）[J].Autophagy，2007，3（4）：374-376.
[14]荣华，董海影，张静艳，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马CA3区超微结构的改变及脑组织ERK蛋白表达的影响[J].中国医学创新，2013，10（36）：10-12.
[15]金铭，蔡珍珍，董海影，等.β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马组织及Bax、Bcl-2的影响[J].中国医学创新，2014，11（18）：36-38.
（收稿日期：2015-12-09） （本文编辑：王利）