大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

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烟酰胺单核苷酸(NMN)是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽Pel B实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Sfnampt)、磷酸核糖焦磷酸激酶(Tkprs)和核糖激酶(Erbks)。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45℃、50℃和37℃,最适p H分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35℃热稳定性良好而在40~55℃较差;Tkprs在40~60℃热稳定性良好;Erbks在25~40℃热稳定性良好而在45℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65μmol/(L·min)、2.37μmol/(L·min)、12.58μmol/(L·min),Km分别为2.87μmol/L、25.48μmol/L和74.13μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37℃、p H 8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50μmol/L的NMN。本研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。
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