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摘要：为探讨猪转化生长因子β1（TGFβ1）及其受体（TGFβRⅠ）基因多态性与大白猪和长白猪产活仔数的相关性。采用PCR-SSCP方法检测了[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]第6内含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]第7内含子中与猪繁殖力相关的2个突变位点在大白猪和长白猪（共计232头）中的单核苷酸多态性，同时分析多态位点基因型与大白猪和长白猪产活仔数的关联性。结果发现：[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第7外显子上游的第9位碱基存在C→T突变，在大白猪和长白猪中均检出CC和TT 2种基因型，且不同基因型对2猪种产活仔数的影响差异不显著（P>0.05）；TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子第808位碱基存在A→G突变，在大白猪中检出AA、AG、GG 3种基因型，长白猪中未检出GG基因型，大白猪中GG型母猪产活仔数极显著高于AA型（P<0.01），长白猪中，AA型和AG型产活仔数的影响差异不显著（P>0.05）。研究结果表明，[WTBX][STBX]TGFβ1基因的突变位点对大白猪和长白猪的产活仔数没有显著影响，TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多态位点与母猪产活仔数显著相关，可作为猪分子遗传育种的候选基因，加快猪育种进程。
关键词：猪；基因；TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；PCR-SSCP；产活仔数
中图分类号： S828.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）02-0038-04
收稿日期：2015-03-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：30901014、31460586）；留学回国人员科研启动基金。
TGFβ1是转化生长因子家族的重要成员之一，具有促进细胞生长、分化、迁移，参与免疫调节、细胞外间质形成、创伤愈合、组织修复、胚胎发育等生物学功能[1]。其受体TGFβRⅠ属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族，在大多数细胞和组织中普遍表达，其胞内区具有丝氮酸/苏氨酸激酶结构域，即GS区，具有激酶活性。在TGFβ/SMAD信号通路的信号转导是由有活性的TGFβ1首先和TGFβRⅡ结合形成异源二聚体复合物，该异源二聚体能够使TGFβRⅠGS区的丝氨酸和苏氨酸磷酸化，激活TGFβRⅠ激酶，活化的TGFβRⅠ激酶再与下游的SMADs蛋白家族发生磷酸化，从而将配体信号跨膜转导入细胞核中，进而引起一系列的生物学效应[2]。TGFβ1与其受体TGFβRⅠ直接参与下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，在促进卵子成熟，黄体形成，及子宫内膜及滋养细胞的增殖与分化方面起着重要的作用[3]。
已有研究证实，TGFβ1与动物繁殖有着密切的关系，TGFβ1在卵巢细胞内的表达随着动物物种、卵泡发育阶段的不同而有所差异，但在多种动物卵泡发育阶段都呈时空性表达[4]；Wimmers 等通过 PCR-SSCP 检测到皮特兰猪、柏林小型猪，在TGFβ1第 5 外显子的 798 碱基（AF461808）存在1个单核苷酸多态（SNP）[5]；武艳萍等研究发现大白猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因多态性与产仔数间呈显著关联（P<0.05）[6]；王嘉博发现[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 基因T4位点的 AA 型总产仔数最高，对母猪生产性状的影响极显著，对仔猪出生体质量及断奶体质量影响不显著[7]。李海晶等研究发现大白猪TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多态性与产仔数间呈显著关联（P<0.05）[8]。根据以上TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因对繁殖的影响，本试验以TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]作为候选基因进行研究，选取大白猪111头，长白猪121头为研究材料，采用PCR-SSCP技术，对猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內含子进行多态性检测，分析其多态性与猪产仔数之间的关联性，为进一步提高猪繁殖性能，实现猪的遗传改良提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验选取健康无病的大白猪111头和长白猪121头，分别来自新疆科盛种猪场和新疆142团种猪场，用耳号钳采集耳组织样本0.1 g，置于70%乙醇溶液中，-80 ℃保存备用。
1.2试验试剂
Taq MIX，购自CWBIO公司；DNA marker、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自TIANGEN公司；pGEM-T Vector、T4 DNA连接酶，购自Promega公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞，为石河子大学动物遗传育种与繁殖实验室保存。
1.3猪耳组织DNA的提取
取猪耳组织，用灭菌小剪刀充分剪碎，处理样品过程中需注意剪刀的消毒，避免交叉污染。根据TIANGEN动物组织DNA提取试剂盒操作步骤提取猪耳组织基因组DNA。
1.4PCR-SSCP引物设计
根据已知的猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子区的1 156 bp序列（序列：AJ621785中的第1 043位点）[6]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子区的1 259 bp序列中突变位点（序列：DQ519377中的第65 753位点）[8]，利用Primer 50软件设计扩增[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的特异性上下游引物。引物由北京华大生物工程技术服务有限公司合成，引物序列（表1）。 1.5PCR扩增
以猪耳组织DNA为模板，使用Taq Mix试剂进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 1 μL，补ddH2O 至总反应体系为20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min；保存4 ℃。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6PCR-SSCP
根据PCR产物片段的大小，[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分别使用10%和12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测。取 3 μL 扩增条带明亮单一、片段大小符合预期的PCR产物和 8 μL Loading buffer，瞬时离心混匀。PCR仪98 ℃变性 10 min 后迅速冰浴10 min，取10 μL变性后的PCR产物上样。120 V稳压电泳12 h，银染显带，确定纯合子和杂合子带型，并拍照记录。
1.7PCR产物的克隆测序
利用普通琼脂糖回收试剂盒对PCR-SSCP检测到的同一引物不同带型的PCR产物进行回收，将纯化产物与pGEM-T载体连接，连接体系为：2×Rapid Ligation buffer 5 μL，PCR 产物3 μL，pGEM-T Vector 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，PCR仪中16 ℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37 ℃过夜培养，挑选阳性菌落，37 ℃扩大培养8 h，将选取的阳性菌株送交北京华大生物工程技术服务有限公司测序。
1.8数据统计
根据PCR-SSCP银染显影带型的显示，统计计算等位基因的基因频率和基因型频率，利用SPSS 17.0软件中的 One-way ANOVA方法进行方差分析，LSD法进行组间差异显著性检验，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型与大白猪和长白猪产活仔数性状的相关性，不同基因对应的产活仔数用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.1PCR-SSCP检测结果
对猪耳组织DNA用[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子特异性引物扩增，对扩增产物分别进行10%和12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。在2个猪种[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因引物扩增片段均上发现1个突变位点，检测到2种基因型，分别命名为CC型和TT型，结果见图1；在2个猪种TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因引物扩增片段上均发现1个突变位点，大白猪中检测到3种基因型，长白猪中检测到2种基因型，分别命名为AA型、AG型及GG型，结果见图2。
2.2测序结果及分析
经SSCP分型后，将不同基因型个体的PCR产物用普通琼脂糖胶回收试剂盒纯化回收后连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α送样测序。测序结果经DNAMAN和Chrimas软件分析后，发现在[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]引物扩增片段的第156碱基处发生了C→T突变，此突变位点位于[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第7外显子上游的第9位碱基（序列：AJ621785中的第1 043位点）。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物扩增片段的第112碱基处发生了A→G突变，此突变位点位于TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子第808位碱基（序列：DQ519377中的第65 753位点）。[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因不同基因型个体测序结果分别见图3、图4。
2.3不同猪种[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的等位基因和基因型频率分析
对[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白猪和长白猪中的基因频率和基因型频率进行统计（表2、表3），[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白猪和长白猪中均检测到CC、TT 2种基因型，未检测到CT基因型，等位基因C占优势。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白猪中检测到AA、AG、GG 3种基因型，等位基因A占优势；在长白猪中检测到AA、AG 2种基因型，未检测到GG基因型，等位基因A占优势。
2.4[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型对猪产活仔数的影响
利用SPSS 17.0软件对统计结果进行One-way ANOVA分析，LSD法进行组间差异显著性检验，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]各突變位点不同基因型与母猪产活仔数性状的相关性，不同基因对应的产活仔数用平均值±标准差表示。结果（表4）显示[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白猪和长白猪中，CC型和TT型产活仔数之间均没有显著差异（P>0.05），产活仔数趋势均为TT>CC。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因大白猪中，GG型和AG型产活仔数极显著高于AA型（P<0.01），GG型产活仔数显著高于AG型（P<0.05），产活仔数趋势为GG>AG>AA；长白猪中，AA型和AG型产活仔数之间差异不显著，产活仔数趋势为AG>AA。
关键词：猪；基因；TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；PCR-SSCP；产活仔数
中图分类号： S828.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）02-0038-04
收稿日期：2015-03-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：30901014、31460586）；留学回国人员科研启动基金。
TGFβ1是转化生长因子家族的重要成员之一，具有促进细胞生长、分化、迁移，参与免疫调节、细胞外间质形成、创伤愈合、组织修复、胚胎发育等生物学功能[1]。其受体TGFβRⅠ属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族，在大多数细胞和组织中普遍表达，其胞内区具有丝氮酸/苏氨酸激酶结构域，即GS区，具有激酶活性。在TGFβ/SMAD信号通路的信号转导是由有活性的TGFβ1首先和TGFβRⅡ结合形成异源二聚体复合物，该异源二聚体能够使TGFβRⅠGS区的丝氨酸和苏氨酸磷酸化，激活TGFβRⅠ激酶，活化的TGFβRⅠ激酶再与下游的SMADs蛋白家族发生磷酸化，从而将配体信号跨膜转导入细胞核中，进而引起一系列的生物学效应[2]。TGFβ1与其受体TGFβRⅠ直接参与下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，在促进卵子成熟，黄体形成，及子宫内膜及滋养细胞的增殖与分化方面起着重要的作用[3]。
已有研究证实，TGFβ1与动物繁殖有着密切的关系，TGFβ1在卵巢细胞内的表达随着动物物种、卵泡发育阶段的不同而有所差异，但在多种动物卵泡发育阶段都呈时空性表达[4]；Wimmers 等通过 PCR-SSCP 检测到皮特兰猪、柏林小型猪，在TGFβ1第 5 外显子的 798 碱基（AF461808）存在1个单核苷酸多态（SNP）[5]；武艳萍等研究发现大白猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因多态性与产仔数间呈显著关联（P<0.05）[6]；王嘉博发现[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 基因T4位点的 AA 型总产仔数最高，对母猪生产性状的影响极显著，对仔猪出生体质量及断奶体质量影响不显著[7]。李海晶等研究发现大白猪TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因多态性与产仔数间呈显著关联（P<0.05）[8]。根据以上TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因对繁殖的影响，本试验以TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]作为候选基因进行研究，选取大白猪111头，长白猪121头为研究材料，采用PCR-SSCP技术，对猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7內含子进行多态性检测，分析其多态性与猪产仔数之间的关联性，为进一步提高猪繁殖性能，实现猪的遗传改良提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
本试验选取健康无病的大白猪111头和长白猪121头，分别来自新疆科盛种猪场和新疆142团种猪场，用耳号钳采集耳组织样本0.1 g，置于70%乙醇溶液中，-80 ℃保存备用。
1.2试验试剂
Taq MIX，购自CWBIO公司；DNA marker、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自TIANGEN公司；pGEM-T Vector、T4 DNA连接酶，购自Promega公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞，为石河子大学动物遗传育种与繁殖实验室保存。
1.3猪耳组织DNA的提取
取猪耳组织，用灭菌小剪刀充分剪碎，处理样品过程中需注意剪刀的消毒，避免交叉污染。根据TIANGEN动物组织DNA提取试剂盒操作步骤提取猪耳组织基因组DNA。
1.4PCR-SSCP引物设计
根据已知的猪[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子区的1 156 bp序列（序列：AJ621785中的第1 043位点）[6]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子区的1 259 bp序列中突变位点（序列：DQ519377中的第65 753位点）[8]，利用Primer 50软件设计扩增[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的特异性上下游引物。引物由北京华大生物工程技术服务有限公司合成，引物序列（表1）。 1.5PCR扩增
以猪耳组织DNA为模板，使用Taq Mix试剂进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 1 μL，补ddH2O 至总反应体系为20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min；保存4 ℃。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6PCR-SSCP
根据PCR产物片段的大小，[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分别使用10%和12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测。取 3 μL 扩增条带明亮单一、片段大小符合预期的PCR产物和 8 μL Loading buffer，瞬时离心混匀。PCR仪98 ℃变性 10 min 后迅速冰浴10 min，取10 μL变性后的PCR产物上样。120 V稳压电泳12 h，银染显带，确定纯合子和杂合子带型，并拍照记录。
1.7PCR产物的克隆测序
利用普通琼脂糖回收试剂盒对PCR-SSCP检测到的同一引物不同带型的PCR产物进行回收，将纯化产物与pGEM-T载体连接，连接体系为：2×Rapid Ligation buffer 5 μL，PCR 产物3 μL，pGEM-T Vector 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，PCR仪中16 ℃连接过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布平板，37 ℃过夜培养，挑选阳性菌落，37 ℃扩大培养8 h，将选取的阳性菌株送交北京华大生物工程技术服务有限公司测序。
1.8数据统计
根据PCR-SSCP银染显影带型的显示，统计计算等位基因的基因频率和基因型频率，利用SPSS 17.0软件中的 One-way ANOVA方法进行方差分析，LSD法进行组间差异显著性检验，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型与大白猪和长白猪产活仔数性状的相关性，不同基因对应的产活仔数用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.1PCR-SSCP检测结果
对猪耳组织DNA用[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第6内含子和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子特异性引物扩增，对扩增产物分别进行10%和12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。在2个猪种[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因引物扩增片段均上发现1个突变位点，检测到2种基因型，分别命名为CC型和TT型，结果见图1；在2个猪种TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因引物扩增片段上均发现1个突变位点，大白猪中检测到3种基因型，长白猪中检测到2种基因型，分别命名为AA型、AG型及GG型，结果见图2。
2.2测序结果及分析
经SSCP分型后，将不同基因型个体的PCR产物用普通琼脂糖胶回收试剂盒纯化回收后连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α送样测序。测序结果经DNAMAN和Chrimas软件分析后，发现在[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]引物扩增片段的第156碱基处发生了C→T突变，此突变位点位于[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因第7外显子上游的第9位碱基（序列：AJ621785中的第1 043位点）。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]引物扩增片段的第112碱基处发生了A→G突变，此突变位点位于TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因第7内含子第808位碱基（序列：DQ519377中的第65 753位点）。[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ] 和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因不同基因型个体测序结果分别见图3、图4。
2.3不同猪种[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的等位基因和基因型频率分析
对[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白猪和长白猪中的基因频率和基因型频率进行统计（表2、表3），[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白猪和长白猪中均检测到CC、TT 2种基因型，未检测到CT基因型，等位基因C占优势。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因在大白猪中检测到AA、AG、GG 3种基因型，等位基因A占优势；在长白猪中检测到AA、AG 2种基因型，未检测到GG基因型，等位基因A占优势。
2.4[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]不同基因型对猪产活仔数的影响
利用SPSS 17.0软件对统计结果进行One-way ANOVA分析，LSD法进行组间差异显著性检验，分析[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]和TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]各突變位点不同基因型与母猪产活仔数性状的相关性，不同基因对应的产活仔数用平均值±标准差表示。结果（表4）显示[WTBX][STBX]TGFβ1[WTBZ][STBZ]基因在大白猪和长白猪中，CC型和TT型产活仔数之间均没有显著差异（P>0.05），产活仔数趋势均为TT>CC。TGFβR[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因大白猪中，GG型和AG型产活仔数极显著高于AA型（P<0.01），GG型产活仔数显著高于AG型（P<0.05），产活仔数趋势为GG>AG>AA；长白猪中，AA型和AG型产活仔数之间差异不显著，产活仔数趋势为AG>AA。