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摘要：采用平板凝集试验、试管凝集试验对采自新疆3个集约化养殖鹿场、1个散养鹿群的410份血清样本进行布氏杆菌特异性抗体检测；采用分子生物学方法，根据GenBank公布的布氏杆菌外膜蛋白Omp25c的基因序列设计特异性引物，对疑似布氏杆菌阳性的10份羊水病料进行PCR扩增，并将扩增产物克隆到pGEM-T Easy Vector进行测序。结果表明，血清稀释比例为1 ∶25时，平板凝集试验、试管凝集试验的抗体阳性率分别为15.1%、14.6%，4份羊水样本的PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上均观察到预期149 bp大小的扩增条带，BLAST比对分析显示该扩增序列与布氏杆菌基因组的核苷酸序列同源性为100%，从而判定新疆集约化养殖的天山马鹿存在布氏杆菌病的感染。
关键词：布氏杆菌；天山马鹿；平板凝集；试管凝集；Omp25c
中图分类号：S852.61 2；S858.255.1 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0235-02
布氏杆菌病（brucellosis）又称马尔他热、波状热，是由布氏杆菌属（Brucella）细菌引起的人畜共患病。布氏杆菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤。该病最典型的症状为怀孕母畜流产、空怀不育、子宫炎、乳房炎，以及公畜睾丸炎、关节炎等。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。全世界有170多个国家和地区存在和流行人畜共患布氏杆菌病，每年因该病造成的经济损失约30亿美元[1]。根据其宿主的嗜好性可将布氏杆菌分为猪、牛、羊、犬、绵羊附睾、沙林鼠种布鲁氏菌6个种及20个型[2]。我国鹿群中流行的布鲁氏菌主要为猪型、牛型、羊型、非典型布鲁氏菌[3-4]。天山马鹿是产于新疆维吾尔自治区天山山脉的鹿品种，是国家二类保护动物。目前，关于新疆天山马鹿感染布氏杆菌的情况尚未见报道，更无应用分子生物学手段对天山马鹿进行布氏杆菌流行病学的检测及研究。通过对新疆地区集约化养殖、散养的天山马鹿进行布氏杆菌病流行病学调查，以了解当地天山马鹿的布氏杆菌感染状况。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清及病料来源410份血清样本分别采自新疆地区3个集约化养殖鹿场、1个散养鹿群；10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料采自新疆地区集约化养殖鹿场。
1.1.2试验菌株布氏杆菌疫苗株M5购自新疆天康畜牧生物技术公司。
1.1.3主要试剂及仪器设备HiPure Gel Pure DNA Kits，购自Magen公司；pGEM-T Easy Vector，购自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase，均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；布氏杆菌虎红平板凝集抗原、布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清，均购自中国兽医药品监察所；布氏杆菌阴性参考血清为笔者所在实验室保存。梯度PCR仪、全自动凝胶成像分析系统、高速离心机均为德国Eppendorf公司产品。
1.2方法
1.2.1虎红平板凝集试验虎红平板凝集试验是一种快速、敏感的检测方法，用于布氏杆菌病的田间筛选，具体操作及判定方法参照GB/T 18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》。
1.2.2试管凝集试验试管凝集试验是一种特异、敏感的布氏杆菌病检测方法，用于布氏杆菌病的诊断，具体操作及判定方法参照GB/T 18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》。
1.2.3布氏杆菌基因组DNA的制备将疑似布氏杆菌阳性的羊水病料划线接种于TSA琼脂平板，置于培养箱中37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种至TSB培养基。取1 mL TSB培养物以12 000 r/min离心5 min，弃上清。
以200 μL TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6）重悬沉淀，于95 ℃煮沸5 min，以12 000 r/min离心 10 min，上清即为细菌DNA模板。
1.2.4样品的PCR检测根据布氏杆菌特异性基因Omp25c的保守片段，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列为：Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′；Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。
所采用的25 μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL、无RNA酶的水17.0 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，取5 μL反应产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。
1.2.5PCR扩增产物的纯化、克隆、测序采用HiPure Gel Pure DNA Kits试剂盒，按照说明书对电泳后的PCR产物进行回收并纯化，将纯化回收的PCR产物连接至pGEM-T Easy Vector。连接产物按常规方法转化大肠杆菌感受态DH5α（天根公司产品）并进行氨苄青霉素抗性筛选。选择抗性菌落增菌培养，并采用质粒小提试剂盒从扩增的细菌培养物中提取质粒，将PCR鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
2结果与分析
2.1血清学检测结果
用PBS溶液对采集的410份天山马鹿血清依次进行倍比稀释（1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200），并分别采用平板凝集试验、试管凝集试验进行检测，检测结果见表1、表2。 2.2PCR检测结果
应用针对特异性基因Omp25c保守片段设计的引物，分别对疑似阳性病料、对照疫苗菌株M5的DNA模板进行PCR扩增。结果显示，10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料中有4份呈阳性，阳性率为40%，在1.2%琼脂糖凝胶上观察到预期大小为149 bp的扩增条带。采用M13通用引物对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的核苷酸序列进行BLAST对比，证明所扩增及克隆的核酸片段为布氏杆菌Omp25c保守的核苷酸序列。阳性样品的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，扩增子测序序列的BLAST比对分析结果见图2。
3结论与讨论
布鲁氏菌病是由布氏杆菌引起的一种人兽共患传染病，布氏杆菌是一种兼性胞内寄生菌，具有逃避机体免疫保护的能力。对于布氏杆菌病的诊断，GB/T18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》规定的虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）一直是我国动物布病检测的经典试验方法[5]。然而，对于受到免疫抑制且携带病原的宿主动物，抗体水平很难达到有效的检测滴度，需借助分子生物学方法来检测动物体内的病原体，因此必须筛选布氏杆菌种间高度保守的目的基因，而Omp25c是目前最具代表性的布氏杆菌外膜蛋白之一，具有较强的免疫原性，且在布氏杆菌各种间高度保守[6-7]。以Omp25c外膜蛋白为研究对象，选取特异性较好的基因片段设计引物，进行动物体内布氏杆菌病原菌的检测。
近年来，新疆地区多个畜种均有布氏杆菌病感染的报道[8-10]，严重威胁当地人畜健康及畜牧业的安全生产。天山马鹿是产于新疆维吾尔自治区天山山脉的鹿品种，是国家二类保护动物。早期，野生天山马鹿在新疆较为多见，随着近年来市场对天山马鹿所产鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角胶等鹿产品需求的不断扩大，天山马鹿在新疆呈现集约化养殖的趋势。有文献初步报道，新疆天山马鹿由野生放养到与其他家畜混养，曾出现过布氏杆菌感染的病例[11-12]，然而上述流行病学调查研究均仅限于血清学水平，不能排除假阳性、假阴性存在的情况。为系统了解新疆天山马鹿集约化养殖后，布氏杆菌病在该畜群中的流行状况，本研究采用血清学与分子生物学相结合的技术手段，对当地天山马鹿布氏杆菌病的感染情况进行系统的流行病学调查。结果表明，新疆天山马鹿集约化养殖后确实出现了布氏杆菌病感染的病例。对血清样品进行布氏杆菌特异性抗体检测时，平行采用虎红平板凝集试验与试管凝集试验，然而以不同方法对同一批血清测得的阳性率不同，可见仅靠血清学检测抗体的方法难以对畜群感染布氏杆菌的程度进行定论。以布氏杆菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因为研究对象，从10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料中筛选出4份阳性病例，进一步提供了布氏杆菌感染新疆天山马鹿的证据。确定感染新疆天山马鹿的布氏杆菌种型尚需进一步研究，从而有针对性地对天山马鹿进行布氏杆菌病的防控。
参考文献：
[1]Seleem M N，Boyle S M，Sriranganathan N. Brucellosis：a remerging zoonosis[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（3/4）：392-398.
[2]Díaz-Apancio E，Marin C，Alonso-Urmeneta B，et al. Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis in fection of goats[J]. Clin Microbiol，2004，32（5）：1159-1165.
[3]邓小红，曾政，王希良. 布鲁氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制[J]. 中国兽医科学，2007，37（6）：505-509.
[4]陈伟业，胡森，黄克和，等. IS711和omp2作为布氏杆菌种属及种株间分子鉴别诊断标记的研究[J]. 中国预防兽医学报，2006，28（6）：676-680.
[5]郑锦玲，蒋成砚，董仲生，等. 布氏杆菌病检测技术的研究进展[J]. 中国农学通报，2006，22（6）：25-28.
[6]曲勍，王玉飞，乔凤，等. Omp25c基因对马耳他布鲁菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响[J]. 生物技术通讯，2009，20（5）：639-642.
[7]Caro H P，Fernandez L L，de Miguel M J，et al. Role of the omp25/omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis[J]. Infection and Immunity，2007，75（8）：4050-4061.
[8]李玲，闫晶华，闫昊，等. 新疆畜间布鲁氏菌病流行情况及防制技术研究[J]. 草食家畜，2012，156（3）：19-22.
[9]石琴，袁立岗，蒲敬伟，等. 山区牧场牛羊布鲁氏菌病感染情况调查与分析[J]. 中国动物检疫，2013，30（2）：40-41.
[10]张鲁安，苏贵成，李 杰，等. 新疆生产建设兵团畜间布病监测分析及防控对策[J]. 新疆农垦科技，2012（4）：26-28.
[11]曾鹏武，李灵，陈胜文. 天山马鹿布鲁氏菌病的检疫和防制[J]. 中国兽医科技，2004，34（1）：73-75.
[12]孟庆玲，杨奋东，贾桂珍，等. 昌吉地区天山马鹿布氏杆菌病血清学调查[J]. 塔里木大学学报，2006，18（3）：32-33.
王海， 王康环， 蒋小松，等. 优质肉鸡硫胺素含量以及TPK1基因的多态性分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：237-239.
关键词：布氏杆菌；天山马鹿；平板凝集；试管凝集；Omp25c
中图分类号：S852.61 2；S858.255.1 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0235-02
布氏杆菌病（brucellosis）又称马尔他热、波状热，是由布氏杆菌属（Brucella）细菌引起的人畜共患病。布氏杆菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤。该病最典型的症状为怀孕母畜流产、空怀不育、子宫炎、乳房炎，以及公畜睾丸炎、关节炎等。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。全世界有170多个国家和地区存在和流行人畜共患布氏杆菌病，每年因该病造成的经济损失约30亿美元[1]。根据其宿主的嗜好性可将布氏杆菌分为猪、牛、羊、犬、绵羊附睾、沙林鼠种布鲁氏菌6个种及20个型[2]。我国鹿群中流行的布鲁氏菌主要为猪型、牛型、羊型、非典型布鲁氏菌[3-4]。天山马鹿是产于新疆维吾尔自治区天山山脉的鹿品种，是国家二类保护动物。目前，关于新疆天山马鹿感染布氏杆菌的情况尚未见报道，更无应用分子生物学手段对天山马鹿进行布氏杆菌流行病学的检测及研究。通过对新疆地区集约化养殖、散养的天山马鹿进行布氏杆菌病流行病学调查，以了解当地天山马鹿的布氏杆菌感染状况。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清及病料来源410份血清样本分别采自新疆地区3个集约化养殖鹿场、1个散养鹿群；10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料采自新疆地区集约化养殖鹿场。
1.1.2试验菌株布氏杆菌疫苗株M5购自新疆天康畜牧生物技术公司。
1.1.3主要试剂及仪器设备HiPure Gel Pure DNA Kits，购自Magen公司；pGEM-T Easy Vector，购自Promega公司；Trans 2K DNA Markers、Trans Taq-T DNA Polymerase，均购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；布氏杆菌虎红平板凝集抗原、布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清，均购自中国兽医药品监察所；布氏杆菌阴性参考血清为笔者所在实验室保存。梯度PCR仪、全自动凝胶成像分析系统、高速离心机均为德国Eppendorf公司产品。
1.2方法
1.2.1虎红平板凝集试验虎红平板凝集试验是一种快速、敏感的检测方法，用于布氏杆菌病的田间筛选，具体操作及判定方法参照GB/T 18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》。
1.2.2试管凝集试验试管凝集试验是一种特异、敏感的布氏杆菌病检测方法，用于布氏杆菌病的诊断，具体操作及判定方法参照GB/T 18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》。
1.2.3布氏杆菌基因组DNA的制备将疑似布氏杆菌阳性的羊水病料划线接种于TSA琼脂平板，置于培养箱中37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种至TSB培养基。取1 mL TSB培养物以12 000 r/min离心5 min，弃上清。
以200 μL TE（1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.6）重悬沉淀，于95 ℃煮沸5 min，以12 000 r/min离心 10 min，上清即为细菌DNA模板。
1.2.4样品的PCR检测根据布氏杆菌特异性基因Omp25c的保守片段，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列为：Omp25c FP 5′-TTTGGATGAAAATAACGCC-3′；Omp25c RP 5′-ATTCGCCCCTGTTTCTCA-3′。
所采用的25 μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U）0.5 μL、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL、无RNA酶的水17.0 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应结束后，取5 μL反应产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。
1.2.5PCR扩增产物的纯化、克隆、测序采用HiPure Gel Pure DNA Kits试剂盒，按照说明书对电泳后的PCR产物进行回收并纯化，将纯化回收的PCR产物连接至pGEM-T Easy Vector。连接产物按常规方法转化大肠杆菌感受态DH5α（天根公司产品）并进行氨苄青霉素抗性筛选。选择抗性菌落增菌培养，并采用质粒小提试剂盒从扩增的细菌培养物中提取质粒，将PCR鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
2结果与分析
2.1血清学检测结果
用PBS溶液对采集的410份天山马鹿血清依次进行倍比稀释（1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200），并分别采用平板凝集试验、试管凝集试验进行检测，检测结果见表1、表2。 2.2PCR检测结果
应用针对特异性基因Omp25c保守片段设计的引物，分别对疑似阳性病料、对照疫苗菌株M5的DNA模板进行PCR扩增。结果显示，10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料中有4份呈阳性，阳性率为40%，在1.2%琼脂糖凝胶上观察到预期大小为149 bp的扩增条带。采用M13通用引物对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的核苷酸序列进行BLAST对比，证明所扩增及克隆的核酸片段为布氏杆菌Omp25c保守的核苷酸序列。阳性样品的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，扩增子测序序列的BLAST比对分析结果见图2。
3结论与讨论
布鲁氏菌病是由布氏杆菌引起的一种人兽共患传染病，布氏杆菌是一种兼性胞内寄生菌，具有逃避机体免疫保护的能力。对于布氏杆菌病的诊断，GB/T18646—2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》规定的虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）一直是我国动物布病检测的经典试验方法[5]。然而，对于受到免疫抑制且携带病原的宿主动物，抗体水平很难达到有效的检测滴度，需借助分子生物学方法来检测动物体内的病原体，因此必须筛选布氏杆菌种间高度保守的目的基因，而Omp25c是目前最具代表性的布氏杆菌外膜蛋白之一，具有较强的免疫原性，且在布氏杆菌各种间高度保守[6-7]。以Omp25c外膜蛋白为研究对象，选取特异性较好的基因片段设计引物，进行动物体内布氏杆菌病原菌的检测。
近年来，新疆地区多个畜种均有布氏杆菌病感染的报道[8-10]，严重威胁当地人畜健康及畜牧业的安全生产。天山马鹿是产于新疆维吾尔自治区天山山脉的鹿品种，是国家二类保护动物。早期，野生天山马鹿在新疆较为多见，随着近年来市场对天山马鹿所产鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿筋、鹿角胶等鹿产品需求的不断扩大，天山马鹿在新疆呈现集约化养殖的趋势。有文献初步报道，新疆天山马鹿由野生放养到与其他家畜混养，曾出现过布氏杆菌感染的病例[11-12]，然而上述流行病学调查研究均仅限于血清学水平，不能排除假阳性、假阴性存在的情况。为系统了解新疆天山马鹿集约化养殖后，布氏杆菌病在该畜群中的流行状况，本研究采用血清学与分子生物学相结合的技术手段，对当地天山马鹿布氏杆菌病的感染情况进行系统的流行病学调查。结果表明，新疆天山马鹿集约化养殖后确实出现了布氏杆菌病感染的病例。对血清样品进行布氏杆菌特异性抗体检测时，平行采用虎红平板凝集试验与试管凝集试验，然而以不同方法对同一批血清测得的阳性率不同，可见仅靠血清学检测抗体的方法难以对畜群感染布氏杆菌的程度进行定论。以布氏杆菌高度保守的Omp25c外膜蛋白基因为研究对象，从10份疑似布氏杆菌阳性的羊水病料中筛选出4份阳性病例，进一步提供了布氏杆菌感染新疆天山马鹿的证据。确定感染新疆天山马鹿的布氏杆菌种型尚需进一步研究，从而有针对性地对天山马鹿进行布氏杆菌病的防控。
参考文献：
[1]Seleem M N，Boyle S M，Sriranganathan N. Brucellosis：a remerging zoonosis[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（3/4）：392-398.
[2]Díaz-Apancio E，Marin C，Alonso-Urmeneta B，et al. Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis in fection of goats[J]. Clin Microbiol，2004，32（5）：1159-1165.
[3]邓小红，曾政，王希良. 布鲁氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制[J]. 中国兽医科学，2007，37（6）：505-509.
[4]陈伟业，胡森，黄克和，等. IS711和omp2作为布氏杆菌种属及种株间分子鉴别诊断标记的研究[J]. 中国预防兽医学报，2006，28（6）：676-680.
[5]郑锦玲，蒋成砚，董仲生，等. 布氏杆菌病检测技术的研究进展[J]. 中国农学通报，2006，22（6）：25-28.
[6]曲勍，王玉飞，乔凤，等. Omp25c基因对马耳他布鲁菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响[J]. 生物技术通讯，2009，20（5）：639-642.
[7]Caro H P，Fernandez L L，de Miguel M J，et al. Role of the omp25/omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis[J]. Infection and Immunity，2007，75（8）：4050-4061.
[8]李玲，闫晶华，闫昊，等. 新疆畜间布鲁氏菌病流行情况及防制技术研究[J]. 草食家畜，2012，156（3）：19-22.
[9]石琴，袁立岗，蒲敬伟，等. 山区牧场牛羊布鲁氏菌病感染情况调查与分析[J]. 中国动物检疫，2013，30（2）：40-41.
[10]张鲁安，苏贵成，李 杰，等. 新疆生产建设兵团畜间布病监测分析及防控对策[J]. 新疆农垦科技，2012（4）：26-28.
[11]曾鹏武，李灵，陈胜文. 天山马鹿布鲁氏菌病的检疫和防制[J]. 中国兽医科技，2004，34（1）：73-75.
[12]孟庆玲，杨奋东，贾桂珍，等. 昌吉地区天山马鹿布氏杆菌病血清学调查[J]. 塔里木大学学报，2006，18（3）：32-33.
王海， 王康环， 蒋小松，等. 优质肉鸡硫胺素含量以及TPK1基因的多态性分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：237-239.