为实现霍山石斛的全质利用和高值化利用，以接种酿酒酵母发酵与自然发酵两种工艺制备霍山石斛酵素，研究不同工艺发酵过程中代谢物（有机酸、总酚、总糖等）和抗氧化活性（OH·清除率、ABTS·清除率、还原力）的变化趋势，并结合多元统计分析，建立综合评价指标。结果表明，酿酒酵母发酵组的酵母菌数量高于自然发酵组；自然发酵组检测到的4种有机酸的含量均高于酿酒酵母发酵组，其中乳酸和乙酸含量均呈上升趋势；酿酒酵母发酵组的草酸含量明显下降，而自然发酵组的草酸含量没有明显变化。酿酒酵母发酵组与自然发酵组的总酚含量分别下降了24.02%、24.98%;总糖含量分别下降了64.21%、22.89%;pH值分别下降了0.12和0.24,总酸含量分别增加了62.98%、70.98%;糖酸比分别降低了80.13%、59.47%,酿酒酵母生产的酵素口感以酸甜为主，自然发酵的酵素口感以甜为主。在抗氧化方面，酿酒酵母发酵组显著高于自然发酵组，OH·清除能力分别提高了42.57%和40.67%;ABTS·清除能力分别提高了55.36%和30.06%;还原力无显著变化。相关性分析和主成分分析结果表明乳酸、乙酸等有机酸具有一定的抗氧化性。酵母菌发酵第14 d的综合评价指标达到阶段高点，酵母菌生长数量在14 d后趋于稳定，进入生长稳定期，可作为最佳发酵节点。综上结果表明酿酒酵母发酵相较于自然发酵霍山石斛提高了抗氧化活性，丰富了酵素口感，缩短了发酵时间，酵素品质较好。