【摘 要】
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目的 建立黏质沙雷菌（Serratia marcescens）Benzonase?核酸内切酶（Serratia marcescens Benzonase? endonuclease,SMBE）通用型定量检测方法，并进行验证。方法 以突变体SMBE（第110位组氨酸突变为丙氨酸）基因BEHA为模板，PCR法扩增BEHA基因，插入至载体pET-20b（+）中，构建重组表达质粒pET-20b（+）-BE
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201903D321087）；
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目的 建立黏质沙雷菌（Serratia marcescens）Benzonase?核酸内切酶（Serratia marcescens Benzonase? endonuclease,SMBE）通用型定量检测方法，并进行验证。方法 以突变体SMBE（第110位组氨酸突变为丙氨酸）基因BEHA为模板，PCR法扩增BEHA基因，插入至载体pET-20b（+）中，构建重组表达质粒pET-20b（+）-BEHA，经菌落PCR和测序鉴定。重组表达质粒转化E. coli BL21（DE3）pLysS,IPTG诱导表达后进行一步Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化，纯化产物经15%SDS-PAGE和分光光度计分析，并检测酶活性。用纯化BEHA免疫家兔，以获得的多克隆抗体作为包被抗体，标记HRP的多克隆抗体作为检测抗体，建立SMBE的双抗体夹心ELISA检测法。验证方法的线性范围、准确度、精密性，并确定定量限。采用建立的方法及市售试剂盒分别检测3个厂家生产的SMBE。结果 菌落PCR和测序鉴定证明，重组表达质粒pET-20b（+）-BEHA构建正确，第110位氨基酸成功突变为丙氨酸。BEHA的纯度＞ 95%，表达量为3 mg/100 mL，酶活性大幅降低。SMBE标准品在0～20 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系；16、10、0.6 ng/mL的SMBE标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%;12和2 ng/mL的SMBE标准品重复10次检测结果 CV分别为2.48%和2.91%；定量限为0.2 ng/mL。与市售试剂盒比较，本研究建立的方法对3个厂家生产的SMBE检测结果更接近理论值。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有较好的准确度和精密性，该方法可定量检测多种市售SMBE产品，是一种SMBE的通用型定量检测方法。
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