人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国极具特色的中草药,具有药食兼用特点,其人参皂苷被视为人参的主要活性成分,约占人参总质量的2~3%。红参(Red Ginseng,RG)是人参的熟用品,在蒸制过程中,会使人参中的原始皂苷成分在高温状态下,发生糖基断链及C-20位脱水/异构化而产生次级皂苷,是临床应用最为常见的人参加工品。由于红参富含人参皂苷Rg3等次级皂苷,药效更温,活性更强,以补气益血、生精安神、增强机体免疫力等作用被广泛应用于加工品及其相关剂型中,是阴盛阳虚者的首选补品。为深入开发人参及其炮制品,本文首先探讨了不同炮制时间和温度对RG中次级皂苷产生的影响,在确定其产生的最佳条件的基础上,然后,对红参中含有的次级皂苷进行提取、分离制备,最后,通过建立小鼠阴囊热应激模型,探究人参皂苷Rg3对其保护作用,并揭示其分子机制。1.不同炮制时间和烘干温度对RG中次级皂苷的影响:本实验通过鲜参在蒸制2h、3h、4h情况下,比较炮制时间对次级皂苷产生的影响,并结合30℃、50℃、70℃进一步探究不同烘干温度下次级皂苷含量的变化。通过研究发现,在蒸制2h、3h、4h时间后,分别置于30℃、50℃、70℃恒温烘干约48h,粉碎后,甲醇超声提取,利用HPLC法检测不同炮制参数所获得的的9批RG样品中15种人参皂苷类成分含量,经定量分析可知,在蒸制2h、3h和4h后,置于不同烘干温度情况下,在一定范围内,Rk3、Rh4、Rg3、Rk1和Rg5等次级皂苷含量呈明显上升趋势,且烘干温度在一定程度上也会影响次级皂苷的产生。综合数据变化,各因素对RG炮制的工艺影响程度是不同的,其影响顺序大致为:蒸制时间>烘干温度,从而在确定蒸制温度前提下,蒸制4h,烘干温度50℃能使RG中次级皂苷的总含量达到最大值。此研究为全面综合评价RG的加工工艺提供一定的理论参考,同时亦为RG的深度开发提供物质基础。2.RG中次级皂苷的提取与制备分离:综合上章RG的加工工艺所获得的红参样品,采用常规中药提取手段,通过大孔树脂、硅胶、ODS等常规柱色谱分离和半制备高效液相色谱分离相结合。共从RG样品中分离得到10种单体人参皂苷成分,根据原有标准品及其他手段对其成分进行进一步鉴定,分别为人参皂苷(S)-Rg2、(R)-Rg2、(S)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、(R)-Rg3、Rk1、Rg5。3.Rg3对阴囊热应激(Heat stress,HS)致睾丸损伤的保护作用:人参皂苷Rg3(ginsenoside Rg3,G-Rg3)是人参次级皂苷的代表性成分,也是RG及其加工品中的指标性成分之一。基于人参皂苷类成分对生精障碍的有益作用,本研究还进一步探究G-Rg3对HS所致小鼠睾丸损伤的保护作用。在适应性饲养7天后,将ICR小鼠随机分为:对照组(Control),模型组(恒温水浴42℃,18min),G-Rg3低剂量组(5 mg/kg)、G-Rg3高剂量(10 mg/kg)组。将G-Rg3混悬于0.05%(w/v)羧甲基纤维素钠(CMC-Na),给药组连续灌胃给药14天,对照组和HS组分别给以同样方式给以0.05%的CMC-Na。给药第7天1h后造模,即除Control组外,将其余各组小鼠的下腹部置于42℃水浴中持续18min。实验结果表明:与模型组相比,G-Rg3可明显抑制HS所致的血清中睾酮含量降低,并且两个剂量均能不同程度抑制睾丸组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平升高及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽转移酶(GSH)的水平降低。同时,组织病理学H&E染色进一步证明了G-Rg3的保护作用。此外,G-Rg3可明显抑制氧化蛋白的表达改善氧化应激缓解睾丸损伤。通过TUNEL、免疫组织化学染色和Western blot分析可知,G-Rg3可明显抑制生殖细胞数目减少和生精小管萎缩、凋亡,并明显缩小坏死及空泡区域,也说明G-Rg3具有抑制细胞凋亡的作用。从而充分揭示G-Rg3能通过MAPK信号通路,利用ROS介导的氧化应激和细胞凋亡而发挥抗HS损伤作用。综上所述,本论文通过不同炮制时间和烘干温度,确定RG中次级皂苷产生的最佳条件,并进一步对其进行制备分离,获得(S)-Rg2、(R)-Rg2、(S)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、(R)-Rg3、Rk1、Rg5等10种单体皂苷类成分,为后期的药理学实验提供了必要的物质保证。同时,基于G-Rg3作为RG中是最具代表性次级皂苷,对脑、肝、肾等多个器官均具有极强的药用价值,本文较为深入的阐明了G-Rg3对阴囊热应激所致的小鼠睾丸损伤的保护作用及可能的分子机制,为从生殖角度深入开发人参次级皂苷及相关加工品提供了新的研究思路,也为人参在临床治疗男性不育和指导生殖保健提供理论参考。