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[摘要] 目的 对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。 方法 按《中国药典》（2010年版）附录ⅪH无菌检查方法进行。 结果 在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。 结论 可以采用此法对本品的无菌进行检查。
[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法
[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02
Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection
WU Yulan JI Haicheng
Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China
[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.
[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure
盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。本品具有抗菌谱广、抗菌作用强的特点，适用于敏感细菌引起的呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、皮肤软组织感染等的中、重度感染。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[1-6]，本品为大容量最终灭菌注射液，按照《中国药典》（2010年版）二部附录ⅪH[7]的要求，要进行无菌检查。
1 实验材料
1.1 仪器
HTY-2000A全封闭集菌仪和KSF集菌培养器（杭州高德泰林有限公司）、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器有限公司）、生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、MJX-160B霉菌培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、AKL1500净化工作台（苏州华宏净化技术有限公司）。
1.2 试剂
培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。
实验菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]，以上菌种均由江苏省药检所提供，传代次数均为第3代。
稀释液：pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1 mol/L硫酸锰溶液、0.9%无菌氯化钠溶液（NS），本实验室配制。
1.3 供试品
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液（规格/100 mL：0.2 g：0.9 g、批号/100804、100805、100806）
2 方法与结果
2.1 样品供试液制备
取供试品原液作为供试液。
2.2 菌液的制备和计数
分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液（NS）10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。取生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物与标准比浊管对比，取与比浊管相当的菌液用NS按10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物，用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液用NS10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。以上各菌悬液或孢子悬液同时各取2份注入琼脂培养基，采用平皿计数法计数，结果见表1。
2.3 无菌检查过程
2.3.1 培养基的灵敏度检查 取12 mL/管的硫乙醇酸盐流体培养基管9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌各2支，另1支作为空白对照，培养3 d；取9 mL/管的真菌培养基管，分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支作为空白对照，培养5 d。在培养的3～5 d内，空白对照管均无菌生长，加菌的各培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 2.3.2 培养基的无菌性检查 取两种培养基各5瓶，分别置于各自的培养温度下空白培养14 d，均无菌生长，判该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的无菌性检查符合规定。
2.3.3 无菌检查方法的验证 试验组：取1套二联培养器，先用50 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜。将20瓶供试液全量通过二个滤器，然后用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（1000 mL/膜，80 mL/次），边冲洗边震荡，在2个滤器的最后一次冲洗液中分别加入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，最后各加入含2 mL 0.1 mol/L硫酸锰溶液的100 mL硫乙醇酸盐流体培养基，作为供试品阳性对照。
阳性对照组：另取1套培养器，不加供试品，其他同上操作，作为阳性对照。
阴性对照：另取1套滤器，除无供试液、试验菌外同上操作，其中1管加入含2 mL 0.1 mol/L硫酸锰溶液的100 mL硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100 mL改良马丁培养基，作为阴性对照。
取供试品与大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良马丁培养基。
将上述各管按规定温度培养3～5 d。
2.3.4 结果判断 与对照管比较，所有试验组的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计，可按该法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需去除供试品的抑菌作用并重新进行方法验证。
2.3.5 结果记录 见表2。
3 结果与讨论
通过以上验证试验，与对照管相比，6种试验菌的试验组均生长良好。结果提示，采用该法能消除制剂对细菌、真菌的抑制作用，适用于该制剂的无菌检查。
[参考文献]
[1] 张崇生，陶建亮，王芳.盐酸左氧氟沙星注射液的无菌实验方法验证[J].海峡药学，2006，18（4）：58-59.
[2] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.
[3] 中国药品生物制品检定所/中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.
[4] 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验技术[M].北京：华龄出版社，2007：150-200.
[5] 汪穗福.微生物检测验证技术[M].北京：中国医药科技出版社，2005：200-300.
[6] 潘友文.现代医药工业微生物实验质量管理与验证技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2004：110-160.
[7] 国家药典委员会.中国药典二部附录[M].北京：中国医药科技出版社，2010：99-107.
（收稿日期：2013-02-21）
[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法
[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02
Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection
WU Yulan JI Haicheng
Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China
[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.
[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure
盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。本品具有抗菌谱广、抗菌作用强的特点，适用于敏感细菌引起的呼吸系统、泌尿系统、生殖系统、皮肤软组织感染等的中、重度感染。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[1-6]，本品为大容量最终灭菌注射液，按照《中国药典》（2010年版）二部附录ⅪH[7]的要求，要进行无菌检查。
1 实验材料
1.1 仪器
HTY-2000A全封闭集菌仪和KSF集菌培养器（杭州高德泰林有限公司）、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器有限公司）、生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、MJX-160B霉菌培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、AKL1500净化工作台（苏州华宏净化技术有限公司）。
1.2 试剂
培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。
实验菌株：大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]，以上菌种均由江苏省药检所提供，传代次数均为第3代。
稀释液：pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1 mol/L硫酸锰溶液、0.9%无菌氯化钠溶液（NS），本实验室配制。
1.3 供试品
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液（规格/100 mL：0.2 g：0.9 g、批号/100804、100805、100806）
2 方法与结果
2.1 样品供试液制备
取供试品原液作为供试液。
2.2 菌液的制备和计数
分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液（NS）10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。取生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物与标准比浊管对比，取与比浊管相当的菌液用NS按10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物，用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液用NS10倍递增稀释成每毫升含菌数30～100 cfu/mL的菌悬液。以上各菌悬液或孢子悬液同时各取2份注入琼脂培养基，采用平皿计数法计数，结果见表1。
2.3 无菌检查过程
2.3.1 培养基的灵敏度检查 取12 mL/管的硫乙醇酸盐流体培养基管9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌各2支，另1支作为空白对照，培养3 d；取9 mL/管的真菌培养基管，分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支作为空白对照，培养5 d。在培养的3～5 d内，空白对照管均无菌生长，加菌的各培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 2.3.2 培养基的无菌性检查 取两种培养基各5瓶，分别置于各自的培养温度下空白培养14 d，均无菌生长，判该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的无菌性检查符合规定。
2.3.3 无菌检查方法的验证 试验组：取1套二联培养器，先用50 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜。将20瓶供试液全量通过二个滤器，然后用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（1000 mL/膜，80 mL/次），边冲洗边震荡，在2个滤器的最后一次冲洗液中分别加入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，最后各加入含2 mL 0.1 mol/L硫酸锰溶液的100 mL硫乙醇酸盐流体培养基，作为供试品阳性对照。
阳性对照组：另取1套培养器，不加供试品，其他同上操作，作为阳性对照。
阴性对照：另取1套滤器，除无供试液、试验菌外同上操作，其中1管加入含2 mL 0.1 mol/L硫酸锰溶液的100 mL硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100 mL改良马丁培养基，作为阴性对照。
取供试品与大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良马丁培养基。
将上述各管按规定温度培养3～5 d。
2.3.4 结果判断 与对照管比较，所有试验组的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计，可按该法进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需去除供试品的抑菌作用并重新进行方法验证。
2.3.5 结果记录 见表2。
3 结果与讨论
通过以上验证试验，与对照管相比，6种试验菌的试验组均生长良好。结果提示，采用该法能消除制剂对细菌、真菌的抑制作用，适用于该制剂的无菌检查。
[参考文献]
[1] 张崇生，陶建亮，王芳.盐酸左氧氟沙星注射液的无菌实验方法验证[J].海峡药学，2006，18（4）：58-59.
[2] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.
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[5] 汪穗福.微生物检测验证技术[M].北京：中国医药科技出版社，2005：200-300.
[6] 潘友文.现代医药工业微生物实验质量管理与验证技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2004：110-160.
[7] 国家药典委员会.中国药典二部附录[M].北京：中国医药科技出版社，2010：99-107.
（收稿日期：2013-02-21）