【目的】构建用于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)pyr R基因敲除的温敏型敲除载体,为研究pyr R蛋白缺失对胞苷合成的影响奠定基础。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用PCR分别扩增pyr R基因的上游同源序列和下游同源序列,再定向克隆至含卡那抗性基因的p KS1温敏型载体上,构建敲除载体p KS1-pyr R。【结果】经特异性引物对pyr R-S1/pyr R-A1和pyr R-S2/pyr R-A2扩增,获得解淀粉芽孢杆菌目的DNA片段pyr R-up和pyr R-down,大小约500 bp;目的片段经克隆载体p MD19-T连接、Trans1-T1转化,获得的重组质粒分别以Kpn I/Hind III、Pst I/Not I双酶切鉴定和测序后,可获得大小约500 bp的上、下游克隆载体T-pyr R-up和T-pyr R-down。上游克隆载体T-pyr R-up经Kpn I与Hind III双酶切及T4 DNA连接、Trans1-T1转化后,进行重组载体检测和质粒双酶切鉴定,得到大小分别为433、5064 bp的片段,与连接长度一致,构建获得带标记基因的重组载体p KS1-pyr R-up。采用Pst I和Not I对T-pyr R-down和p KS1-pyr R-up同时进行双酶切,经连接、转化、双酶切鉴定后,得到两条长度分别为446和5497 bp的片段,与连接前长度一致,证明pyr R的上、下游同源臂已正确插入到p KS1载体中,获得敲除载体p KS1-pyr R。【结论】构建的解淀粉芽孢杆菌pyr R基因敲除载体p KS1-pyr R可用于研究敲除pyr R基因及pyr R蛋白缺失对胞苷过量合成的影响。