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摘 要：SSR分子标记是一种基于DNA重复序列长度多态性的分子标记技术，是进行群体遗传学结构分析、构建遗传连锁图谱非常有力的工具。应用该技术的前提条件是要有相应的SSR引物，可利用CTAB法提取茶树基因组DNA，对茶树基因组DNA进行MseI酶切连接获得目的基因，将目的基因进行PCR扩增后通过磁珠法洗脱，对产物进行测序，得到目的基因的序列组成。
关键词：茶树；SSR；分子标记；序列
真核生物基因组中含有一类DNA碱基序列，称作微卫星。微卫星DNA即简单序列重复（SSR，Simple Sequence Repeat），是一类由1～6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列。
本实验以PCR技术为基础，利用磁珠富集法获取开发茶树SSR分子标记序列所需的引物。
一、材料和方法
1.茶叶基因组DNA提取与检测
（1）取幼嫩的茶树叶片洗净，用70%乙醇消毒后再用无菌水冲洗，吸干水分，将材料放入研钵，加液氮研磨成粉末状。
（2）将粉末转移至2.0ml离心管中，放入刚才制作的预处理液1mL（0.4mol/L的葡萄糖，3%的聚乙烯吡烷酮），混匀后5000rpm离心，弃上清。
（3）向沉淀中加入630μL预热（65℃）1.5×CTAB提取缓冲液（1.5%CTAB，1.5mol/L NaCl，15mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.2%β-巯基乙醇），加入70μL无水乙醇，65℃水浴45min。
（4）从水浴中取出离心管，冷却后加入600μL氯仿：异戊醇（24∶1），混匀后10000rpm离心10min。
（5）将离心后的上清液转移至另一2mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇混匀，置于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心3min，弃上清。
（6）加入800μLTE buffer（10m mol/L Tris-HCl，1m mol/L EDTA，pH8.0），溶解DNA。
2.茶树基因组DNA的MseI酶切及电泳检测
取一个离心管向其中先后加入16.3μL ddH2O、0.2μL 100×BSA、1μL茶树基因组DNA、2.0μL 10×Buffer、0.5μL MseI（10U/μL），混匀后放至37℃水浴锅中反应三小时，然后65℃处理20min。
3.酶切产物与接头连接
取Oligo-MseI A和Oligo-MseI B分别配制成50μM贮存液，充分溶解后取出等体积Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50μL充分混匀后94℃变性5 min，取出缓慢冷却至室温，保存于-20℃备用。
二、结果
MseI酶切产物电泳后在200bp-800bp范围内出现明显smear区域（图1）。
PCR预扩增产物电泳后在200bp-800bp处出现明显smear区域（图2）。
电泳检测可发现有明显smear区域（图3）。
三、讨论
在常用的获取微卫星引物的办法里，有一种方法比较方便，也是很经济的一种方法，即在已经发表过的文献里面，可以找到微卫星引物，还有一种办法就是可以从总的数据库里面挑选出微卫星的具体位置。到今天有些动植物还没有关于SSR标记的研究报道，近缘物种又相对较少，必须开发引物。在选择以何种方法获得微卫星位点时，有2个因素决定了筛选方法的选择：①研究的目的；②所需要的微卫星数目。除以上2个因素外，对于多数研究者来说，实验室的技术设备，以及分离微卫星的费用也是不得不考虑的因素。综合以上因素，对于SSR含量较少的物种最好采用富集策略提高分离效率，以此来节约时间和资金。比较富集法中各种微卫星位点开发策略，基于磁珠富集法所需设备简单，技术要求较低，周期相对较短，适合多数实验室开展工作。
参考文献：
[1]Litt M，Luty JA.A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene[J].Am.J.Hum.Genet，1989，44（3）：397-401.
[2]Diethard Tautz，Martin Trick，Gabriel A，Dover.Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation[J].NATURE，322（6080）：652-656.
[3]Wayne Powell，Gordon C，Machray，Jim Provan.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Plant Sci，1996，1（7）：215-222.
关键词：茶树；SSR；分子标记；序列
真核生物基因组中含有一类DNA碱基序列，称作微卫星。微卫星DNA即简单序列重复（SSR，Simple Sequence Repeat），是一类由1～6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列。
本实验以PCR技术为基础，利用磁珠富集法获取开发茶树SSR分子标记序列所需的引物。
一、材料和方法
1.茶叶基因组DNA提取与检测
（1）取幼嫩的茶树叶片洗净，用70%乙醇消毒后再用无菌水冲洗，吸干水分，将材料放入研钵，加液氮研磨成粉末状。
（2）将粉末转移至2.0ml离心管中，放入刚才制作的预处理液1mL（0.4mol/L的葡萄糖，3%的聚乙烯吡烷酮），混匀后5000rpm离心，弃上清。
（3）向沉淀中加入630μL预热（65℃）1.5×CTAB提取缓冲液（1.5%CTAB，1.5mol/L NaCl，15mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.2%β-巯基乙醇），加入70μL无水乙醇，65℃水浴45min。
（4）从水浴中取出离心管，冷却后加入600μL氯仿：异戊醇（24∶1），混匀后10000rpm离心10min。
（5）将离心后的上清液转移至另一2mL离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇混匀，置于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心3min，弃上清。
（6）加入800μLTE buffer（10m mol/L Tris-HCl，1m mol/L EDTA，pH8.0），溶解DNA。
2.茶树基因组DNA的MseI酶切及电泳检测
取一个离心管向其中先后加入16.3μL ddH2O、0.2μL 100×BSA、1μL茶树基因组DNA、2.0μL 10×Buffer、0.5μL MseI（10U/μL），混匀后放至37℃水浴锅中反应三小时，然后65℃处理20min。
3.酶切产物与接头连接
取Oligo-MseI A和Oligo-MseI B分别配制成50μM贮存液，充分溶解后取出等体积Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50μL充分混匀后94℃变性5 min，取出缓慢冷却至室温，保存于-20℃备用。
二、结果
MseI酶切产物电泳后在200bp-800bp范围内出现明显smear区域（图1）。
PCR预扩增产物电泳后在200bp-800bp处出现明显smear区域（图2）。
电泳检测可发现有明显smear区域（图3）。
三、讨论
在常用的获取微卫星引物的办法里，有一种方法比较方便，也是很经济的一种方法，即在已经发表过的文献里面，可以找到微卫星引物，还有一种办法就是可以从总的数据库里面挑选出微卫星的具体位置。到今天有些动植物还没有关于SSR标记的研究报道，近缘物种又相对较少，必须开发引物。在选择以何种方法获得微卫星位点时，有2个因素决定了筛选方法的选择：①研究的目的；②所需要的微卫星数目。除以上2个因素外，对于多数研究者来说，实验室的技术设备，以及分离微卫星的费用也是不得不考虑的因素。综合以上因素，对于SSR含量较少的物种最好采用富集策略提高分离效率，以此来节约时间和资金。比较富集法中各种微卫星位点开发策略，基于磁珠富集法所需设备简单，技术要求较低，周期相对较短，适合多数实验室开展工作。
参考文献：
[1]Litt M，Luty JA.A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene[J].Am.J.Hum.Genet，1989，44（3）：397-401.
[2]Diethard Tautz，Martin Trick，Gabriel A，Dover.Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation[J].NATURE，322（6080）：652-656.
[3]Wayne Powell，Gordon C，Machray，Jim Provan.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Plant Sci，1996，1（7）：215-222.