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摘要：以蓬蘽悬钩子的带腋芽嫩茎段为外植体，建立组织培养再生体系。结果表明：适宜腋芽诱导培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA，诱导率可达86.7%；适宜增殖培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA；适宜生根培养基为改良的1/2MS 0.1 mg/L NAA；适宜炼苗时间为7 d，移栽成活率可达98%；以6月中旬移栽到大田的当年苗木生长发育状态最佳。
关键词：蓬蘽悬钩子；初代培养；继代培养；根诱导；移栽
中图分类号： S663.204 .3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0074-02
蓬蘽悬钩子（Rubus crataegifolius Bunge）为蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）植物，别称托盘儿、覆盆子等，是我国长白山区分布量较大的野生树莓种质资源。蓬蘽悬钩子抗寒性强，果实品质好、营养丰富[1]，且根、茎、叶、果均可入药[2-3]，开发利用前景广阔。2013年以来，笔者在系统开展蓬蘽悬钩子野生驯化研究的同时，进行组织培养快繁技术研究，以期为优良种质资源快速高效利用、建立我国寒地特色树莓产区、实现栽培良种化和生产规范化提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料（嫩茎）取自中国农业科学院特产研究所实验基地（吉林市昌邑区左家镇）蓬蘽悬钩子栽培试验园。
1.2 试验方法
1.2.1 启动培养 在5月中下旬，选择生长健壮且无病虫害的蓬蘽悬钩子单株，剪取嫩梢。在室内剪去嫩梢叶片，剪成 2 cm 左右的带芽茎段。茎段用适当浓度洗衣粉液浸泡 20 min，自来水冲洗12 h后接种。接种前先用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次，再以0.1% HgCl2溶液处理10 min，用无菌水冲洗4～5次。将消毒茎段上下部切去少许，分别接种于B5、MS、改良的1/2MS（大量元素、微量元素、铁盐和肌醇均减半）和改良的1/4MS（大量元素、微量元素、铁盐和肌醇均减为正常量的1/4）的诱导培养基上（以上培养基均附加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA），每个处理接种20瓶，每瓶3个茎段。接种后，每周观察外植体生长状况，2周后统计侧芽萌动情况，计算萌发率。
萌芽率=萌芽数/接种数×100%
；
平均萌芽数=萌芽总数/接种数
。
1.2.2 继代培养 将启动培养中获得的无菌芽苗进行增殖培养。以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），每个处理3次重复，每个处理接种10瓶（每瓶4个外植体），50 d后观察芽的分化和生长状况，并统计分析各处理芽的增殖倍数。
1.2.3 生根培养 将继代培养得到的大量增殖苗分离后转入生根培养基中。生根培养以改良的1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/L），每种培养基接种15瓶（每瓶3株无根苗），接种30 d后，观察试管苗生根和苗木生长情况并统计生根率、平均生根数和平均根长。 相关公式为：生根率=生根苗数/接种数×100%；平均生根数=总根数/生根苗数；平均根长=根的总长度/总生根数。
1.2.4 炼苗移栽 当根长至2～3 cm时，将通过生根培养得到的生根苗分别进行3、7、10 d炼苗，然后以细河沙与腐殖土按1 ∶ 3的比例混合作为移栽基质，在移栽前1 d用0.2%高锰酸钾溶液消毒基质并覆膜24 h，并加强移栽后的环境调控，以期获得较高的移栽成活率。
1.2.5 当年苗木生长发育状况调查 分别于5月中旬、6月中旬和7月中旬将移栽到营养钵中的小苗进行圃地栽培，并于5个月后，即生长期结束后，对其生长发育情况进行调查分析。相关公式为：平均分蘖数=总分蘖数/总苗数；平均茎粗=总茎粗/总苗数；平均生长高度=生长高度总和/总苗数；平均成熟高度=主干的平均生长高度-主干梢部枯死的平均长度。
1.3 培养条件
在以上培养基中加3%蔗糖、0.5%琼脂，调节pH值为58～6.0。培养条件：温度为（25±3）℃，光照度为1 000～2 000 lx，光—暗周期为14 h—10 h。
2 结果与分析
2.1 初代培养
表1试验结果表明，不同的基本培养基中外植体的萌芽率差异显著，其中基本培养基以MS对蓬蘽悬钩子嫩茎的诱导效果最好，接种3 d后就开始启动萌发，培养 20 d 时萌芽率达到86.7%，外植体在培养基上生长良好，叶大嫩绿，芽体较高；其次是改良的1/2MS、1/4MS，培养20 d时萌芽率分别达到66.7%、60.0%，外植体生长一般，叶梢小且偏黄绿色，芽体略矮小。而在B5培养基上，一方面外植体发生的褐化现象严重，另一方面接种5 d后才开始缓慢萌发且萌芽率很低，只有28.5%，此外芽体很小，呈黄绿色。综合以上分析可知，蓬蘽悬钩子初代培养以MS作为基本培养基为宜。
2.2 增殖培养
将诱导得到的萌发芽体接种到增殖培养基中后，围绕芽体这一中心，都能分化出一定数量的不定芽。6-BA、NAA不同浓度组合的增殖倍数之间存在显著性差异，因为6-BA、NAA 2种激素与芽体增殖密切相关，激素的绝对浓度和搭配比例對组培苗的增殖有很大的影响。当6-BA浓度为 1.0 mg/L、NAA浓度为0.2 mg/L时，增殖倍数最高，可达 33.14；当6-BA浓度为1.5 mg/L、NAA浓度为0.1 mg/L时，增殖倍数次之，为32.85。这2个处理（即处理5、处理7）的增殖倍数没有显著差异（表2）。因此，适宜蓬蘽悬钩子的增殖培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA。 2.3 根的诱导
不同浓度的NAA与蓬蘽悬钩子无根苗生根率均有密切关系，在9种培养基中都能诱导生根，即在生根培养基中不添加生长素也可生根。当NAA浓度为0.05、0.10 mg/L时，平均生根数之间差异不显著，但平均根长差异显著。当NAA浓度大于0.15 mg/L时，组培苗基部膨大产生愈伤组织块，植株矮小，叶片黄化，不适于移栽。根数越多，根长适宜且粗壮的，移栽成活率高（表3）。因此综合考虑，在改良的1/2MS培养基中，NAA浓度在0～0.10 mg/L范围内，幼苗生根数随着NAA浓度升高而增加；当NAA浓度大于0.10 mg/L时，生根数反而随着NAA浓度的升高而减少；蓬蘽悬钩子适宜的生根培养基为1/2MS NAA 0.10～0.15 mg/L。
2.4 炼苗移栽
组培苗长期生长在光照、温度和湿度等相对适宜和稳定的环境中，体表几乎没有什么保护组织，如果直接移栽到外界环境中，因其本身适应性差，再加上环境变化较大，很难成活。因此需要进行适当的“炼苗”，使其能逐步适应外界的环境变化，提高成活率。不同的炼苗时间处理下组培苗的移栽成活率差异显著。当炼苗时间为3 d时，可能由于组培苗木质化程度低，仍处于“异养”状态，因此较难适应瓶外的环境，从而使成活率大大降低；当炼苗时间为10 d时，组培苗虽然已经达到“异养”状态，但是培养基已受到外界有菌环境的污染，且根部培养基干燥，较难清洗干净，残留的营养容易引起移栽苗烂根死亡，使成活率降低；而炼苗时间为7 d时，组培苗已经完成驯化且培养基较易清洗干净，移栽苗的成活率最高，可达98%（表4）。
2.5 当年苗木生长发育状况调查
只有将组培苗进行圃地栽培，才能达到苗木繁育的最终目的。5月中旬将苗移栽到大地，此时气温和地温等均较低，不利于根系的生长；6月中旬气温和地温都有所上升，苗木生长较好；而7月中旬移栽苗木时，苗的整体生长期大大缩减。因此从平均分蘖数、平均茎粗、平均成熟高度、平均生长高度等几个方面综合考虑，组培苗进行圃地栽培时，以6月中旬移栽入大地较为适宜（表5）。
3 结论与讨论
本研究以蓬蘽悬钩子嫩梢为试验材料，将带腋芽茎段用75%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，最后，接种到MS培养基上。最佳的增殖培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA，其次为MS 1.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA；进行壮苗培养时，最适宜的培养基为MS 0.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA或者MS 0.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA；瓶内生根最适培养基为改良的1/2MS 010～0.15 mg/L NAA，生根率为100%，平均根数最多可达11.21条/株，平均根长最长可达4.86 cm，根粗健壮。对组培苗当年植株生长发育情况调查发现，以6月中旬移栽到大田的生长发育状态最佳。
蓬蘽悬钩子因其具有较高营养保健价值，日益受到人們的青睐，对其进行组织培养快繁技术研究，可实现野生资源的最大化利用。本研究以蓬蘽悬钩子带腋芽茎段为试材，采用不同培养基、植物激素及其浓度组合，建立了稳定的离体快繁体系，为今后组培苗的工厂化生产提供技术指导，更重要的是可对优质品种的推广利用提供经验借鉴。
参考文献：
[1]赵伟伟，李爱民，张正海，等. 野生树莓蓬蘽悬钩子光合特性研究[J]. 中国果树，2014（1）：28-30.
[2]和加卫，唐开学，杨静全，等. 云南省悬钩子属药用植物资源研究[J]. 中草药，2005，36（7）：1078-1081.
[3]解瑞彬，李秋菊，曹媛媛，等. 树莓的组织培养快繁研究[J]. 天津农业科学，2009，15（3）：23-25.
关键词：蓬蘽悬钩子；初代培养；继代培养；根诱导；移栽
中图分类号： S663.204 .3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0074-02
蓬蘽悬钩子（Rubus crataegifolius Bunge）为蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）植物，别称托盘儿、覆盆子等，是我国长白山区分布量较大的野生树莓种质资源。蓬蘽悬钩子抗寒性强，果实品质好、营养丰富[1]，且根、茎、叶、果均可入药[2-3]，开发利用前景广阔。2013年以来，笔者在系统开展蓬蘽悬钩子野生驯化研究的同时，进行组织培养快繁技术研究，以期为优良种质资源快速高效利用、建立我国寒地特色树莓产区、实现栽培良种化和生产规范化提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料（嫩茎）取自中国农业科学院特产研究所实验基地（吉林市昌邑区左家镇）蓬蘽悬钩子栽培试验园。
1.2 试验方法
1.2.1 启动培养 在5月中下旬，选择生长健壮且无病虫害的蓬蘽悬钩子单株，剪取嫩梢。在室内剪去嫩梢叶片，剪成 2 cm 左右的带芽茎段。茎段用适当浓度洗衣粉液浸泡 20 min，自来水冲洗12 h后接种。接种前先用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3次，再以0.1% HgCl2溶液处理10 min，用无菌水冲洗4～5次。将消毒茎段上下部切去少许，分别接种于B5、MS、改良的1/2MS（大量元素、微量元素、铁盐和肌醇均减半）和改良的1/4MS（大量元素、微量元素、铁盐和肌醇均减为正常量的1/4）的诱导培养基上（以上培养基均附加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA），每个处理接种20瓶，每瓶3个茎段。接种后，每周观察外植体生长状况，2周后统计侧芽萌动情况，计算萌发率。
萌芽率=萌芽数/接种数×100%
；
平均萌芽数=萌芽总数/接种数
。
1.2.2 继代培养 将启动培养中获得的无菌芽苗进行增殖培养。以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），每个处理3次重复，每个处理接种10瓶（每瓶4个外植体），50 d后观察芽的分化和生长状况，并统计分析各处理芽的增殖倍数。
1.2.3 生根培养 将继代培养得到的大量增殖苗分离后转入生根培养基中。生根培养以改良的1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/L），每种培养基接种15瓶（每瓶3株无根苗），接种30 d后，观察试管苗生根和苗木生长情况并统计生根率、平均生根数和平均根长。 相关公式为：生根率=生根苗数/接种数×100%；平均生根数=总根数/生根苗数；平均根长=根的总长度/总生根数。
1.2.4 炼苗移栽 当根长至2～3 cm时，将通过生根培养得到的生根苗分别进行3、7、10 d炼苗，然后以细河沙与腐殖土按1 ∶ 3的比例混合作为移栽基质，在移栽前1 d用0.2%高锰酸钾溶液消毒基质并覆膜24 h，并加强移栽后的环境调控，以期获得较高的移栽成活率。
1.2.5 当年苗木生长发育状况调查 分别于5月中旬、6月中旬和7月中旬将移栽到营养钵中的小苗进行圃地栽培，并于5个月后，即生长期结束后，对其生长发育情况进行调查分析。相关公式为：平均分蘖数=总分蘖数/总苗数；平均茎粗=总茎粗/总苗数；平均生长高度=生长高度总和/总苗数；平均成熟高度=主干的平均生长高度-主干梢部枯死的平均长度。
1.3 培养条件
在以上培养基中加3%蔗糖、0.5%琼脂，调节pH值为58～6.0。培养条件：温度为（25±3）℃，光照度为1 000～2 000 lx，光—暗周期为14 h—10 h。
2 结果与分析
2.1 初代培养
表1试验结果表明，不同的基本培养基中外植体的萌芽率差异显著，其中基本培养基以MS对蓬蘽悬钩子嫩茎的诱导效果最好，接种3 d后就开始启动萌发，培养 20 d 时萌芽率达到86.7%，外植体在培养基上生长良好，叶大嫩绿，芽体较高；其次是改良的1/2MS、1/4MS，培养20 d时萌芽率分别达到66.7%、60.0%，外植体生长一般，叶梢小且偏黄绿色，芽体略矮小。而在B5培养基上，一方面外植体发生的褐化现象严重，另一方面接种5 d后才开始缓慢萌发且萌芽率很低，只有28.5%，此外芽体很小，呈黄绿色。综合以上分析可知，蓬蘽悬钩子初代培养以MS作为基本培养基为宜。
2.2 增殖培养
将诱导得到的萌发芽体接种到增殖培养基中后，围绕芽体这一中心，都能分化出一定数量的不定芽。6-BA、NAA不同浓度组合的增殖倍数之间存在显著性差异，因为6-BA、NAA 2种激素与芽体增殖密切相关，激素的绝对浓度和搭配比例對组培苗的增殖有很大的影响。当6-BA浓度为 1.0 mg/L、NAA浓度为0.2 mg/L时，增殖倍数最高，可达 33.14；当6-BA浓度为1.5 mg/L、NAA浓度为0.1 mg/L时，增殖倍数次之，为32.85。这2个处理（即处理5、处理7）的增殖倍数没有显著差异（表2）。因此，适宜蓬蘽悬钩子的增殖培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA。 2.3 根的诱导
不同浓度的NAA与蓬蘽悬钩子无根苗生根率均有密切关系，在9种培养基中都能诱导生根，即在生根培养基中不添加生长素也可生根。当NAA浓度为0.05、0.10 mg/L时，平均生根数之间差异不显著，但平均根长差异显著。当NAA浓度大于0.15 mg/L时，组培苗基部膨大产生愈伤组织块，植株矮小，叶片黄化，不适于移栽。根数越多，根长适宜且粗壮的，移栽成活率高（表3）。因此综合考虑，在改良的1/2MS培养基中，NAA浓度在0～0.10 mg/L范围内，幼苗生根数随着NAA浓度升高而增加；当NAA浓度大于0.10 mg/L时，生根数反而随着NAA浓度的升高而减少；蓬蘽悬钩子适宜的生根培养基为1/2MS NAA 0.10～0.15 mg/L。
2.4 炼苗移栽
组培苗长期生长在光照、温度和湿度等相对适宜和稳定的环境中，体表几乎没有什么保护组织，如果直接移栽到外界环境中，因其本身适应性差，再加上环境变化较大，很难成活。因此需要进行适当的“炼苗”，使其能逐步适应外界的环境变化，提高成活率。不同的炼苗时间处理下组培苗的移栽成活率差异显著。当炼苗时间为3 d时，可能由于组培苗木质化程度低，仍处于“异养”状态，因此较难适应瓶外的环境，从而使成活率大大降低；当炼苗时间为10 d时，组培苗虽然已经达到“异养”状态，但是培养基已受到外界有菌环境的污染，且根部培养基干燥，较难清洗干净，残留的营养容易引起移栽苗烂根死亡，使成活率降低；而炼苗时间为7 d时，组培苗已经完成驯化且培养基较易清洗干净，移栽苗的成活率最高，可达98%（表4）。
2.5 当年苗木生长发育状况调查
只有将组培苗进行圃地栽培，才能达到苗木繁育的最终目的。5月中旬将苗移栽到大地，此时气温和地温等均较低，不利于根系的生长；6月中旬气温和地温都有所上升，苗木生长较好；而7月中旬移栽苗木时，苗的整体生长期大大缩减。因此从平均分蘖数、平均茎粗、平均成熟高度、平均生长高度等几个方面综合考虑，组培苗进行圃地栽培时，以6月中旬移栽入大地较为适宜（表5）。
3 结论与讨论
本研究以蓬蘽悬钩子嫩梢为试验材料，将带腋芽茎段用75%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，最后，接种到MS培养基上。最佳的增殖培养基为MS 1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA，其次为MS 1.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA；进行壮苗培养时，最适宜的培养基为MS 0.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA或者MS 0.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA；瓶内生根最适培养基为改良的1/2MS 010～0.15 mg/L NAA，生根率为100%，平均根数最多可达11.21条/株，平均根长最长可达4.86 cm，根粗健壮。对组培苗当年植株生长发育情况调查发现，以6月中旬移栽到大田的生长发育状态最佳。
蓬蘽悬钩子因其具有较高营养保健价值，日益受到人們的青睐，对其进行组织培养快繁技术研究，可实现野生资源的最大化利用。本研究以蓬蘽悬钩子带腋芽茎段为试材，采用不同培养基、植物激素及其浓度组合，建立了稳定的离体快繁体系，为今后组培苗的工厂化生产提供技术指导，更重要的是可对优质品种的推广利用提供经验借鉴。
参考文献：
[1]赵伟伟，李爱民，张正海，等. 野生树莓蓬蘽悬钩子光合特性研究[J]. 中国果树，2014（1）：28-30.
[2]和加卫，唐开学，杨静全，等. 云南省悬钩子属药用植物资源研究[J]. 中草药，2005，36（7）：1078-1081.
[3]解瑞彬，李秋菊，曹媛媛，等. 树莓的组织培养快繁研究[J]. 天津农业科学，2009，15（3）：23-25.