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[摘要] 目的 采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒提供特异性材料。 方法 通过用顺丁烯二酰亚胺法制备免疫抗原，通过BALB/c小鼠进行多层次免疫，通过细胞培养融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，使用G蛋白层析法、硫酸铵盐析法等对细胞进行纯化。单抗亚类鉴定采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒。 结果 通过细胞融合、培养、筛选、克隆等，最后筛选出1株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为N5B4；细胞培养上清液体效价为1∶5000，腹水效价为1∶100万；通过标准曲线计算样品中人糖化血红蛋白的浓度为99.2%。 结论 经过筛选获得高特异性、高灵敏度的KET单克隆抗体细胞株。
[关键词] 糖化血紅蛋白；单克隆抗体；糖尿病黄斑水肿
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）11-0022-03
[Abstract] Objective Using hybridoma technique and screened hybridoma cell strains stably， efficiently secreted anti glycosylated hemoglobin monoclonal antibody to provide specific material for the development of glycosylated hemoglobin ELISA kit. Methods The immune antigen was prepared by maleimide method， multi-level immune mice by BALB/c， through cell culture fusion， screening of hybridoma cell culture medium HAT， ammonium sulfate salting out method and G protein chromatography. Monoclonal antibody subclasses were identified by monoclonal antibody subtype identification Kit operation. Results Through cell fusion， screening and cloning culture， etc.， the final selection screened 1 strain stably secreting specific antibody hybridoma cell line， named N5B4； cell culture supernatant liquid was 1∶5000， ascites titer was 1∶100 million； a standard curve to calculate the concentration in the sample human glycated hemoglobin was 99.2%. Conclusion After KET monoclonal antibody cell line to obtain a high specificity and high sensitivity of screening.
[Key words] Glycosylated hemoglobin； Monoclonal antibody； Diabetic macular edema
糖化血红蛋白（HbA1c）是一种非酶糖化产物，其对氧的亲和力明显高于正常的血红蛋白，血液中HbA1c水平增高会阻碍氧在组织中扩散，导致组织缺氧坏死。HbA1c水平增高也会加重视网膜缺氧状态，进一步加重毛细血管扩张，渗漏明显增加，最终导致CSME加重和治疗效果不佳[1，2]。研究表明，DME治疗效果仅与HbA1c水平有关，血糖水平的高低对其无明显影响，这可能与HbA1c的水平反映测定前8～12周血糖的平均水平，血糖浓度的波动对其影响不大，因此，是一项评估糖尿病控制效果的重要指标[3]。因此检测HbA1c的水平，对于临床治疗糖尿病性黄斑水肿有极其重要的意义。本研究利用杂交肿瘤技术制备并筛选出高特异性、高灵敏度的KET单克隆抗体细胞株，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒提供特异性材料，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
试验动物为BLAB/c小鼠20只，均购自上海中科院下属单位上海斯莱克试验动物中心，周龄8～10周，雌雄各10只。
1.2 方法
1.2.1 抗原制备 多肽链N末端缬氨酸上的氨基与葡萄糖C1 发生糖基化。Cys（SH）用于偶联载体蛋白，用顺丁烯二酰亚胺法分别偶联KLH和BSA，制备出我们所需要的免疫抗原。
1.2.2 动物免疫 取8～10周龄BALB/c小鼠20只，将免疫抗原采用多层次动物免疫方法进行免疫，融合前3 d进行1次强化免疫，增加剂量，不要使用佐剂。
1.2.3 细胞融合 细胞融合过程中应注意几个问题：①细胞的比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1∶2～1∶10不等。常用1∶4。②反应时间。③培养液的成分。实验具体操作如下：将Sp2/o细胞和脾细胞混合，离心，取上清，轻轻摇散底部细胞，慢慢加入PEG（150%，0.7 mL）加完后迅速加入25 mL不含血清的培养基以稀释PEG（37℃水浴进行），PEG可以造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互黏连而融合在一起，800 rpm/min离心7 min，弃上清，加入HAT培养基，再加到含有饲养细胞的96孔板内，100 μL/孔，5%CO2、37℃培养。 1.2.4 杂交瘤细胞筛选及克隆化培养 采用间接ELISA法对融合后的细胞进行阳性杂交瘤细胞筛选，将筛选出来的细胞进一步使用有限稀释法进行克隆，然后进行扩大培养，收集并冻存，对其进行鉴定。
1.2.5 单克隆抗体的制备及效价测定 选择20只小鼠，使用1 mL注射器将0.5 mL液体石蜡注入小鼠腹腔，培养1周后，将杂交瘤细胞注射进入小鼠腹腔，剂量为（1～2）×106个/只，1周后观察小鼠腹腔腹水生成情况，使用注射器抽取1～2 mL腹水，离心，取上清液。采用间接ELISA法测定效价，以A值大于阴性的2.1倍的稀释比例的倒数为该抗体效价，-20℃冻存腹水。
1.2.6 单克隆抗体的纯化及亚类鉴定 使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化，按照小鼠单克隆抗体亚型试剂盒说明书进行操作鉴定。
1.3 统计学方法
使用SPSS21.0软件包对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1细胞融合及筛选
通过细胞融合、培养、筛选、克隆等，最后筛选出1株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为N5B4。见表1。
2.2单抗的最大稀释度和腹水效价的测定
细胞培养上清液体效价为1∶5000，腹水效价为1∶100万。
2.3单克隆抗体鉴定
用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度OD值。通过标准曲线计算样品中人糖化血红蛋白的浓度为99.2%，不同浓度样品存放-20℃放置3个月稳定性较高，见表2。
3 讨论
HbA1c是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，在血液中的浓度与血糖浓度呈正比，且不能进行可逆性结合，其随着红细胞消亡而消失，通过检查HbA1c可以评估采血前2～3个月血糖的平均水平。HbA1c与人体内的代谢有密切关系，当其浓度升高时，可影响红细胞对氧的亲和力，其与氧结合能力较强，容易引起组织与细胞缺氧，导致组织与毛细血管坏死，加速心脑血管并发症的形成。HbA1c浓度升高可引起肾小球增厚，引发糖尿病肾病。另外其还能引起血脂和血粘滞度增高，增加心血管疾病发生的风险。因此监测HbA1c在糖尿病患者病情控制、并发症预测、糖尿病患者筛选等方面具有非常重要的作用。国际上已经明确将HbA1c作为糖尿病监测的金标准，由于检测方法尚未完全统一，我国还未将其作为糖尿病的诊断标准。目前临床上对确诊的糖尿病患者进行HbA1c检测，主要目的在于了解患者近期血糖控制效果，为临床治疗提供参考。将HbA1c检测结果作为糖尿病病情控制的指标，对糖尿病高危人群开展HbA1c检测，可以早期发现糖尿病患者，并对其进行早期治疗。
本研究通过采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒提供特异性材料[4]。本实验所制备的1株糖化血红蛋白单克隆抗体具有较强的特异性，经腹水效价测定和竞争ELISA法试验，结果提示本研究制备筛选出来的HbA1c单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
本研究采用混合多层次免疫方法（快速免疫佐剂 “油包水”佐剂 脾脏增强），即第一次采用快速免疫佐剂保护免疫原并使抗原快速吸收[5]；第二次采用“油包水”免疫有利于抗原在体内存在时间；第三次采用抗原直接注射脾脏，使短时间内滴度达到最大效果。通过试验证明，采用混合多层次免疫具有极大的优势：①免疫周期短，与常规免疫相比可以节省3～5周免疫时间[5，6]；②抗原用量少，仅为传统免疫方法的1/3；③不破坏抗原天然构象，易获得针对天然构象的抗体；④抗体达到的滴度高，有利于得到高灵敏度的单克隆抗体细胞株[7，8]。本项目中通过自制抗原，采用混合多层次免疫方法进行动物免疫，经过杂交瘤融合、单克隆筛选、交叉抑制等等一系列试验[9，10]，得到的单克隆杂交瘤细胞株应及时冻存，以防止这些细胞的染色体丢失，发生变异。经过大量的小鼠试验，我们选择了以甘油为诱导剂、细胞注射密度5×106为最佳的腹水生产方案[5-7，11]，得到的HbA1c单克隆抗体抗体灵敏度可达99%以上，特异性达98%以上。
总之，本课题制备特异性好、灵敏度高、稳定性好的糖化血红蛋白单克隆抗体，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒及其他检测方法提供特异性蛋白原料。
[参考文献]
[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. New England Journal of Medicine，2010，362（12）：1090-1101.
[2] 谢荣荣，潘素芳，于湄. 离子交换HPLC法和亲和层析HPLC法检测糖化血红蛋白结果的比较和分析[J]. 中国实验诊断学，2009，10（13）：384-386.
[3] 陈铁军，何云霄. 糖化血红蛋白测定诊断妊娠糖尿病的临床意义[J]. 中国基层医药，2013，（22）：3130.
[4] Manley SE，Sikaris KA，Lu ZX. Validation of an algorithm combining haemoglobin A（1c） and fasting plasma glucose for diagnosis of diabetes mellitus in UK and Australian populations[J]. Diabetic Medicine，2009，（2）：115-121.
[5] Linlin QR，Li Qiurong，Jiang Haitao，et al. Effect of anti-Mou CD52 monoclonal antibody on mouse intestinal pithelial lymphocyles[J]. Transplantation，2009，88：766-772.
[6] Na Young Ji，Mi Young Park，Yun Hee Kang，et al. Evaluation of annexin Ⅱ as a potentialserum marker for hepatecellular carcinoma using a developed sandwich ELISA method[J]. International Jourhal of Molecular Medicine，2009，24：765-771.
[7] Hung Song，Robert FH，Ravy Vajravelu，et al. Radioimmunotherapy of breast cancer metastases with ot-particle emitter 225Ac：Comparing Emcacy with 213Bi and 90Y[J]. Cancer Research，2009，69（23）：8941-8948.
[8] 索艷. 糖化血红蛋白测定方法及影响因素的研究进展[J].医学研究生学报，2010，（2）：210-213.
[9] 梁霄. 糖化血红蛋白与空腹血糖联合检测的临床意义及相关性探讨[J]. 临床误诊误治，2011，27（11）：87-88.
[10] 国秀芝，邱玲. 保存温度和时间对全血及血清中腺苷脱氨酶稳定性的影响[J]. 现代检验医学杂志，2009，（5）：106-110.
[11] Song EY，Qu CF，Rizvi SM，et al. Bismuth-213 radioimmunotherapy with C595 anti-MUC1 monoclonal antibody in an ovarian cancer ascites model[J]. Cancer Biol Ther，2008，7（1）：76-80.
（收稿日期：2014-10-15）
[关键词] 糖化血紅蛋白；单克隆抗体；糖尿病黄斑水肿
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）11-0022-03
[Abstract] Objective Using hybridoma technique and screened hybridoma cell strains stably， efficiently secreted anti glycosylated hemoglobin monoclonal antibody to provide specific material for the development of glycosylated hemoglobin ELISA kit. Methods The immune antigen was prepared by maleimide method， multi-level immune mice by BALB/c， through cell culture fusion， screening of hybridoma cell culture medium HAT， ammonium sulfate salting out method and G protein chromatography. Monoclonal antibody subclasses were identified by monoclonal antibody subtype identification Kit operation. Results Through cell fusion， screening and cloning culture， etc.， the final selection screened 1 strain stably secreting specific antibody hybridoma cell line， named N5B4； cell culture supernatant liquid was 1∶5000， ascites titer was 1∶100 million； a standard curve to calculate the concentration in the sample human glycated hemoglobin was 99.2%. Conclusion After KET monoclonal antibody cell line to obtain a high specificity and high sensitivity of screening.
[Key words] Glycosylated hemoglobin； Monoclonal antibody； Diabetic macular edema
糖化血红蛋白（HbA1c）是一种非酶糖化产物，其对氧的亲和力明显高于正常的血红蛋白，血液中HbA1c水平增高会阻碍氧在组织中扩散，导致组织缺氧坏死。HbA1c水平增高也会加重视网膜缺氧状态，进一步加重毛细血管扩张，渗漏明显增加，最终导致CSME加重和治疗效果不佳[1，2]。研究表明，DME治疗效果仅与HbA1c水平有关，血糖水平的高低对其无明显影响，这可能与HbA1c的水平反映测定前8～12周血糖的平均水平，血糖浓度的波动对其影响不大，因此，是一项评估糖尿病控制效果的重要指标[3]。因此检测HbA1c的水平，对于临床治疗糖尿病性黄斑水肿有极其重要的意义。本研究利用杂交肿瘤技术制备并筛选出高特异性、高灵敏度的KET单克隆抗体细胞株，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒提供特异性材料，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
试验动物为BLAB/c小鼠20只，均购自上海中科院下属单位上海斯莱克试验动物中心，周龄8～10周，雌雄各10只。
1.2 方法
1.2.1 抗原制备 多肽链N末端缬氨酸上的氨基与葡萄糖C1 发生糖基化。Cys（SH）用于偶联载体蛋白，用顺丁烯二酰亚胺法分别偶联KLH和BSA，制备出我们所需要的免疫抗原。
1.2.2 动物免疫 取8～10周龄BALB/c小鼠20只，将免疫抗原采用多层次动物免疫方法进行免疫，融合前3 d进行1次强化免疫，增加剂量，不要使用佐剂。
1.2.3 细胞融合 细胞融合过程中应注意几个问题：①细胞的比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1∶2～1∶10不等。常用1∶4。②反应时间。③培养液的成分。实验具体操作如下：将Sp2/o细胞和脾细胞混合，离心，取上清，轻轻摇散底部细胞，慢慢加入PEG（150%，0.7 mL）加完后迅速加入25 mL不含血清的培养基以稀释PEG（37℃水浴进行），PEG可以造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互黏连而融合在一起，800 rpm/min离心7 min，弃上清，加入HAT培养基，再加到含有饲养细胞的96孔板内，100 μL/孔，5%CO2、37℃培养。 1.2.4 杂交瘤细胞筛选及克隆化培养 采用间接ELISA法对融合后的细胞进行阳性杂交瘤细胞筛选，将筛选出来的细胞进一步使用有限稀释法进行克隆，然后进行扩大培养，收集并冻存，对其进行鉴定。
1.2.5 单克隆抗体的制备及效价测定 选择20只小鼠，使用1 mL注射器将0.5 mL液体石蜡注入小鼠腹腔，培养1周后，将杂交瘤细胞注射进入小鼠腹腔，剂量为（1～2）×106个/只，1周后观察小鼠腹腔腹水生成情况，使用注射器抽取1～2 mL腹水，离心，取上清液。采用间接ELISA法测定效价，以A值大于阴性的2.1倍的稀释比例的倒数为该抗体效价，-20℃冻存腹水。
1.2.6 单克隆抗体的纯化及亚类鉴定 使用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法对小鼠腹水进行纯化，按照小鼠单克隆抗体亚型试剂盒说明书进行操作鉴定。
1.3 统计学方法
使用SPSS21.0软件包对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1细胞融合及筛选
通过细胞融合、培养、筛选、克隆等，最后筛选出1株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为N5B4。见表1。
2.2单抗的最大稀释度和腹水效价的测定
细胞培养上清液体效价为1∶5000，腹水效价为1∶100万。
2.3单克隆抗体鉴定
用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度OD值。通过标准曲线计算样品中人糖化血红蛋白的浓度为99.2%，不同浓度样品存放-20℃放置3个月稳定性较高，见表2。
3 讨论
HbA1c是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，在血液中的浓度与血糖浓度呈正比，且不能进行可逆性结合，其随着红细胞消亡而消失，通过检查HbA1c可以评估采血前2～3个月血糖的平均水平。HbA1c与人体内的代谢有密切关系，当其浓度升高时，可影响红细胞对氧的亲和力，其与氧结合能力较强，容易引起组织与细胞缺氧，导致组织与毛细血管坏死，加速心脑血管并发症的形成。HbA1c浓度升高可引起肾小球增厚，引发糖尿病肾病。另外其还能引起血脂和血粘滞度增高，增加心血管疾病发生的风险。因此监测HbA1c在糖尿病患者病情控制、并发症预测、糖尿病患者筛选等方面具有非常重要的作用。国际上已经明确将HbA1c作为糖尿病监测的金标准，由于检测方法尚未完全统一，我国还未将其作为糖尿病的诊断标准。目前临床上对确诊的糖尿病患者进行HbA1c检测，主要目的在于了解患者近期血糖控制效果，为临床治疗提供参考。将HbA1c检测结果作为糖尿病病情控制的指标，对糖尿病高危人群开展HbA1c检测，可以早期发现糖尿病患者，并对其进行早期治疗。
本研究通过采用杂交瘤技术制备糖化血红蛋白的单克隆抗体并对其进行鉴定，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒提供特异性材料[4]。本实验所制备的1株糖化血红蛋白单克隆抗体具有较强的特异性，经腹水效价测定和竞争ELISA法试验，结果提示本研究制备筛选出来的HbA1c单克隆抗体具有较好的特异性和敏感性。
本研究采用混合多层次免疫方法（快速免疫佐剂 “油包水”佐剂 脾脏增强），即第一次采用快速免疫佐剂保护免疫原并使抗原快速吸收[5]；第二次采用“油包水”免疫有利于抗原在体内存在时间；第三次采用抗原直接注射脾脏，使短时间内滴度达到最大效果。通过试验证明，采用混合多层次免疫具有极大的优势：①免疫周期短，与常规免疫相比可以节省3～5周免疫时间[5，6]；②抗原用量少，仅为传统免疫方法的1/3；③不破坏抗原天然构象，易获得针对天然构象的抗体；④抗体达到的滴度高，有利于得到高灵敏度的单克隆抗体细胞株[7，8]。本项目中通过自制抗原，采用混合多层次免疫方法进行动物免疫，经过杂交瘤融合、单克隆筛选、交叉抑制等等一系列试验[9，10]，得到的单克隆杂交瘤细胞株应及时冻存，以防止这些细胞的染色体丢失，发生变异。经过大量的小鼠试验，我们选择了以甘油为诱导剂、细胞注射密度5×106为最佳的腹水生产方案[5-7，11]，得到的HbA1c单克隆抗体抗体灵敏度可达99%以上，特异性达98%以上。
总之，本课题制备特异性好、灵敏度高、稳定性好的糖化血红蛋白单克隆抗体，为开发糖化血红蛋白ELISA 试剂盒及其他检测方法提供特异性蛋白原料。
[参考文献]
[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. New England Journal of Medicine，2010，362（12）：1090-1101.
[2] 谢荣荣，潘素芳，于湄. 离子交换HPLC法和亲和层析HPLC法检测糖化血红蛋白结果的比较和分析[J]. 中国实验诊断学，2009，10（13）：384-386.
[3] 陈铁军，何云霄. 糖化血红蛋白测定诊断妊娠糖尿病的临床意义[J]. 中国基层医药，2013，（22）：3130.
[4] Manley SE，Sikaris KA，Lu ZX. Validation of an algorithm combining haemoglobin A（1c） and fasting plasma glucose for diagnosis of diabetes mellitus in UK and Australian populations[J]. Diabetic Medicine，2009，（2）：115-121.
[5] Linlin QR，Li Qiurong，Jiang Haitao，et al. Effect of anti-Mou CD52 monoclonal antibody on mouse intestinal pithelial lymphocyles[J]. Transplantation，2009，88：766-772.
[6] Na Young Ji，Mi Young Park，Yun Hee Kang，et al. Evaluation of annexin Ⅱ as a potentialserum marker for hepatecellular carcinoma using a developed sandwich ELISA method[J]. International Jourhal of Molecular Medicine，2009，24：765-771.
[7] Hung Song，Robert FH，Ravy Vajravelu，et al. Radioimmunotherapy of breast cancer metastases with ot-particle emitter 225Ac：Comparing Emcacy with 213Bi and 90Y[J]. Cancer Research，2009，69（23）：8941-8948.
[8] 索艷. 糖化血红蛋白测定方法及影响因素的研究进展[J].医学研究生学报，2010，（2）：210-213.
[9] 梁霄. 糖化血红蛋白与空腹血糖联合检测的临床意义及相关性探讨[J]. 临床误诊误治，2011，27（11）：87-88.
[10] 国秀芝，邱玲. 保存温度和时间对全血及血清中腺苷脱氨酶稳定性的影响[J]. 现代检验医学杂志，2009，（5）：106-110.
[11] Song EY，Qu CF，Rizvi SM，et al. Bismuth-213 radioimmunotherapy with C595 anti-MUC1 monoclonal antibody in an ovarian cancer ascites model[J]. Cancer Biol Ther，2008，7（1）：76-80.
（收稿日期：2014-10-15）