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摘要 为探究纤维素酶法对提取苏子叶中黄酮类化合物的效果，通过单因素试验，得到最佳提取工艺条件：温度为57 ℃，提取时间为1 h，酶的浓度为0.4 mg/mL，提取次数为3次。纤维素酶法的平均回收率为 90.40%，相对标准偏差为5.01%，测得苏子叶中黄酮类化合物的含量为1.609 mg/mL。该法比传统碱液提取苏子叶中黄酮类化合物的提取率提高了3倍以上。
关键词 苏子叶；黄酮类化合物；纤维素酶法；提取
中图分类号 S567.23 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0248-02
Abstract In order to investigate the effect of cellulase on extraction of flavonoids from perilla leaf，through single factor experiment，the optimum extraction conditions were obtained：temperature 57 ℃，extraction time 1 h，the concentration of enzyme 0.4 mg/mL，extracted 3 times.The average recovery of cellulase was 90.40%，the standard deviation was 5.01%，the content of flavonoids measured in perilla leaf was 1.609 mg/mL.This method is better than traditional alkali extraction of flavonoids from perilla leaf，its extraction rate increases by more than 3 times.
Key words perilla leaf；flavonoids；cellulase method；extraction
蘇子叶具有降气消痰、平喘润肠等功效，属于第一批被中国卫生部确定的既是食品又具医药保健功能的物质，可以开发出多种保健食品，在医药、食品工业上具有广泛的用途[1]。黄酮类化合物广泛存在于高等植物体中，是植物长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中则多为游离的苷元[2]。许多研究表明黄酮类化合物具有显著的抗氧化、清除氧自由基、扩张心血管作用，可降血脂、阻断动脉粥样硬化、调节免疫机能、抗炎抗病毒、利胆、强心、镇静镇痛和抗肿瘤等[3]。因而，近年来关于黄酮类化合物的研究尤为活跃。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试植物材料。所用苏子叶产于吉林省延边市。
1.1.2 仪器。TU-1201紫外可见分光光度计（北京普析通用）、HH-4电热恒稳水浴锅（国华电器有限公司）、FA21D4N电子天平、SHB-B95型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）等。
1.1.3 试剂。蒸馏水、乙醇、芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，含量92.5%），5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、稀硫酸等（均为分析纯）。
1.2 试验方法
1.2.1 纤维素酶法提取。将苏子叶晾干，粉碎40～60目[4]，准确称取5.000 0 g置于锥形瓶中，加入200 mL的蒸馏水，浸泡24 h，将pH值调至4.5～6.5[5]，加入纤维素酶放入恒温水浴锅加热，一段时间后将其取出抽滤，滤液在60℃以下加热[6]，待将要得到膏状物质时，停止加热，最后用400 mL 60%乙醇将其溶解，待测。
1.2.2 吸收波长的测定[7]。移取1 mL提取液分别置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液混合，再用60%乙醇定容，混匀静置10 min。以0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液、0.3 mL 10%硝酸铝溶液、2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，再加入60%乙醇定容，得到的溶液作为参比溶液，在400～800 nm扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长为510 nm。
1.2.3 工作曲线回归方程的建立[7]。准确称取芦丁标准试剂10.8 mg于100 mL容量瓶中溶解，并用60%乙醇溶液定容，摇匀，即得到标准品。准确移取上述标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中。依次加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液混匀，用60%乙醇稀释至刻度线，10 min后于波长510 nm处测定其吸光度。得线性回归方程为A=0.055 2c-0.002 3，R2=0.999 7[8]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 温度对黄酮类化合物提取率的影响。纤维素酶的最适温度范围为45～65 ℃[9]。因此，分别选取温度为45、49、53、57、61、65 ℃，提取时间为1 h，纤维素酶的浓度为0.8 mg/mL，提取1次按1.2.1的提取方法试验。结果表明，当温度为57 ℃时黄酮类化合物提取率最高（图1）。
2.1.2 时间对黄酮类化合物提取率的影响。分别选取时间为0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h，温度为57 ℃，纤维素酶的浓度为0.8 mg/mL，提取1次。结果表明，当提取1 h时黄酮类化合物提取率最高（图2）。 2.1.3 纤维素酶浓度对黄酮类化合物提取率的影响。分别选取纤维素酶浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，温度为57 ℃，提取时间为1 h，提取1次。结果表明，纤维素酶浓度为0.4 mg/mL时黄酮类化合物提取率最高（图3）。
2.1.4 提取次数对黄酮类化合物提取率的影响。设置温度为57 ℃，提取时间为1 h，纤维素酶浓度为0.4 mg/mL，分别提取1、2、3、4、5次（提取次数≥2时，后一次提取液要与前面提取液混合）。从图4可以看出，当提取3次后，曲线处于缓慢上升状态，提取率稍有提高，但从药品成本和工作量等因素综合考虑，提取3次最佳。
2.2 精密度、加样回收与稳定性试验
2.2.1 精密度试验。按1.2.1的提取方法提取3次，制备4个不同浓度的样品，分别在510nm波长下测定吸光度9次，计算其浓度和平均值，求得标准偏差，结果见表1。
2.2.2 加样回收试验。称取苏子叶粉末3份，在样品中加入芦丁标准品5.0 mg，将样品和标准品混合物按1.2.1的方法提取3次，结果见表2。
2.2.3 稳定性试验。按照样品测定方法，分别在0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 h测定同一样品溶液的吸光度，试验结果表明样品测定液中的黄酮在2.0 h內稳定。
3 结论
本试验以测得苏子叶中黄酮类化合物含量为指标，采用纤维素酶法，以温度、提取时间、纤维素酶浓度和提取次数为变量进行试验，利用紫外分光光度法进行检测，经过数据处理结果和图像分析，得到最佳提取工艺条件：温度为57 ℃、提取时间为1 h、纤维素酶浓度为0.4 mg/mL、提取次数为3次，测得苏子叶中黄酮类化合物的含量为1.609 mg/g。
本试验提取3次，做了精密度试验和加样回收试验，精密度试验的相对标准偏差<1.76%，加样回收试验的平均回收率为90.40%，相对标准偏差为5.01%。
纤维素酶法提取苏子叶中黄酮类化合物的研究表明，酶反应时将植物组织分解，较大提高了黄酮类化合物的提取率，比传统提取碱液提取效率要高很多，高小龙等[9]用碱液提取苏子叶中黄酮类化合，提取率为0.482 mg/g，而用纤维素酶法提取，提取率为1.609 mg/g，比传统碱液提取率高了3倍多，而且耗能少、污染少、操作相对简便。但是，温度、pH值、纤维素酶的浓度、提取时间和提取次数都会影响酶的活性，直接关系到黄酮类化合物的提取率，因而增强酶的活力是考察的重点方面。例如，可以对天然纤维素进行处理，以改变天然纤维素的结构，降低纤维素的结晶度，脱去木质素，以增加纤维素和纤维素酶的接触面积，提高纤维素酶的效率[10]。随着酶学的发展，纤维素酶在提取植物有效成分方面的应用必然有更为广阔的发展前景。
4 参考文献
[1] 云南植物研究所.中国植物志[M].北京：科学出版社，1997：54.
[2] 哈成勇.天然产物化学与应用[M].北京：化学工业出版社，2003：338.
[3] 梅钧，汤自豪.药用植物中黄酮类化合物免疫调节作用研究进[J].九江医学，2009，24（4）：90-92.
[4] 唐浩国.黄酮类化合物研究[M].北京：科学出版社，2009：36
[5] 何国庆，丁立孝.食品酶学[M].北京：化学工业出版社，2006：112.
[6] 曹键，师俊玲.食品酶学[M].郑州：郑州大学出版社，2011：34
[7] 姜显光，侯冬岩，回瑞华，等.马兰叶中总黄酮的提取[J].天然产物研究与开发，2011，23（5）：967-969.
[8] 曹键，师俊玲.食品酶学[M].郑州：郑州大学出版社，2011：170
[9] 高小龙，董远清，刘冬雪，等.碱液法浸提苏子叶中黄酮类化合物及含量测定[J].鞍山师范学院学报，2015（17）：93-95.
[10] 宋述芹，谷茂，陈飞鹏，等.固相微萃取气质联用分析罗勒花和叶的挥发性成分[J].质普学报，2008，29（2）：110-114.
关键词 苏子叶；黄酮类化合物；纤维素酶法；提取
中图分类号 S567.23 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0248-02
Abstract In order to investigate the effect of cellulase on extraction of flavonoids from perilla leaf，through single factor experiment，the optimum extraction conditions were obtained：temperature 57 ℃，extraction time 1 h，the concentration of enzyme 0.4 mg/mL，extracted 3 times.The average recovery of cellulase was 90.40%，the standard deviation was 5.01%，the content of flavonoids measured in perilla leaf was 1.609 mg/mL.This method is better than traditional alkali extraction of flavonoids from perilla leaf，its extraction rate increases by more than 3 times.
Key words perilla leaf；flavonoids；cellulase method；extraction
蘇子叶具有降气消痰、平喘润肠等功效，属于第一批被中国卫生部确定的既是食品又具医药保健功能的物质，可以开发出多种保健食品，在医药、食品工业上具有广泛的用途[1]。黄酮类化合物广泛存在于高等植物体中，是植物长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中则多为游离的苷元[2]。许多研究表明黄酮类化合物具有显著的抗氧化、清除氧自由基、扩张心血管作用，可降血脂、阻断动脉粥样硬化、调节免疫机能、抗炎抗病毒、利胆、强心、镇静镇痛和抗肿瘤等[3]。因而，近年来关于黄酮类化合物的研究尤为活跃。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试植物材料。所用苏子叶产于吉林省延边市。
1.1.2 仪器。TU-1201紫外可见分光光度计（北京普析通用）、HH-4电热恒稳水浴锅（国华电器有限公司）、FA21D4N电子天平、SHB-B95型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）等。
1.1.3 试剂。蒸馏水、乙醇、芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，含量92.5%），5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液、稀硫酸等（均为分析纯）。
1.2 试验方法
1.2.1 纤维素酶法提取。将苏子叶晾干，粉碎40～60目[4]，准确称取5.000 0 g置于锥形瓶中，加入200 mL的蒸馏水，浸泡24 h，将pH值调至4.5～6.5[5]，加入纤维素酶放入恒温水浴锅加热，一段时间后将其取出抽滤，滤液在60℃以下加热[6]，待将要得到膏状物质时，停止加热，最后用400 mL 60%乙醇将其溶解，待测。
1.2.2 吸收波长的测定[7]。移取1 mL提取液分别置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液混合，再用60%乙醇定容，混匀静置10 min。以0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液、0.3 mL 10%硝酸铝溶液、2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，再加入60%乙醇定容，得到的溶液作为参比溶液，在400～800 nm扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长为510 nm。
1.2.3 工作曲线回归方程的建立[7]。准确称取芦丁标准试剂10.8 mg于100 mL容量瓶中溶解，并用60%乙醇溶液定容，摇匀，即得到标准品。准确移取上述标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中。依次加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，5 min后再加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液混匀，用60%乙醇稀释至刻度线，10 min后于波长510 nm处测定其吸光度。得线性回归方程为A=0.055 2c-0.002 3，R2=0.999 7[8]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 温度对黄酮类化合物提取率的影响。纤维素酶的最适温度范围为45～65 ℃[9]。因此，分别选取温度为45、49、53、57、61、65 ℃，提取时间为1 h，纤维素酶的浓度为0.8 mg/mL，提取1次按1.2.1的提取方法试验。结果表明，当温度为57 ℃时黄酮类化合物提取率最高（图1）。
2.1.2 时间对黄酮类化合物提取率的影响。分别选取时间为0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h，温度为57 ℃，纤维素酶的浓度为0.8 mg/mL，提取1次。结果表明，当提取1 h时黄酮类化合物提取率最高（图2）。 2.1.3 纤维素酶浓度对黄酮类化合物提取率的影响。分别选取纤维素酶浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，温度为57 ℃，提取时间为1 h，提取1次。结果表明，纤维素酶浓度为0.4 mg/mL时黄酮类化合物提取率最高（图3）。
2.1.4 提取次数对黄酮类化合物提取率的影响。设置温度为57 ℃，提取时间为1 h，纤维素酶浓度为0.4 mg/mL，分别提取1、2、3、4、5次（提取次数≥2时，后一次提取液要与前面提取液混合）。从图4可以看出，当提取3次后，曲线处于缓慢上升状态，提取率稍有提高，但从药品成本和工作量等因素综合考虑，提取3次最佳。
2.2 精密度、加样回收与稳定性试验
2.2.1 精密度试验。按1.2.1的提取方法提取3次，制备4个不同浓度的样品，分别在510nm波长下测定吸光度9次，计算其浓度和平均值，求得标准偏差，结果见表1。
2.2.2 加样回收试验。称取苏子叶粉末3份，在样品中加入芦丁标准品5.0 mg，将样品和标准品混合物按1.2.1的方法提取3次，结果见表2。
2.2.3 稳定性试验。按照样品测定方法，分别在0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 h测定同一样品溶液的吸光度，试验结果表明样品测定液中的黄酮在2.0 h內稳定。
3 结论
本试验以测得苏子叶中黄酮类化合物含量为指标，采用纤维素酶法，以温度、提取时间、纤维素酶浓度和提取次数为变量进行试验，利用紫外分光光度法进行检测，经过数据处理结果和图像分析，得到最佳提取工艺条件：温度为57 ℃、提取时间为1 h、纤维素酶浓度为0.4 mg/mL、提取次数为3次，测得苏子叶中黄酮类化合物的含量为1.609 mg/g。
本试验提取3次，做了精密度试验和加样回收试验，精密度试验的相对标准偏差<1.76%，加样回收试验的平均回收率为90.40%，相对标准偏差为5.01%。
纤维素酶法提取苏子叶中黄酮类化合物的研究表明，酶反应时将植物组织分解，较大提高了黄酮类化合物的提取率，比传统提取碱液提取效率要高很多，高小龙等[9]用碱液提取苏子叶中黄酮类化合，提取率为0.482 mg/g，而用纤维素酶法提取，提取率为1.609 mg/g，比传统碱液提取率高了3倍多，而且耗能少、污染少、操作相对简便。但是，温度、pH值、纤维素酶的浓度、提取时间和提取次数都会影响酶的活性，直接关系到黄酮类化合物的提取率，因而增强酶的活力是考察的重点方面。例如，可以对天然纤维素进行处理，以改变天然纤维素的结构，降低纤维素的结晶度，脱去木质素，以增加纤维素和纤维素酶的接触面积，提高纤维素酶的效率[10]。随着酶学的发展，纤维素酶在提取植物有效成分方面的应用必然有更为广阔的发展前景。
4 参考文献
[1] 云南植物研究所.中国植物志[M].北京：科学出版社，1997：54.
[2] 哈成勇.天然产物化学与应用[M].北京：化学工业出版社，2003：338.
[3] 梅钧，汤自豪.药用植物中黄酮类化合物免疫调节作用研究进[J].九江医学，2009，24（4）：90-92.
[4] 唐浩国.黄酮类化合物研究[M].北京：科学出版社，2009：36
[5] 何国庆，丁立孝.食品酶学[M].北京：化学工业出版社，2006：112.
[6] 曹键，师俊玲.食品酶学[M].郑州：郑州大学出版社，2011：34
[7] 姜显光，侯冬岩，回瑞华，等.马兰叶中总黄酮的提取[J].天然产物研究与开发，2011，23（5）：967-969.
[8] 曹键，师俊玲.食品酶学[M].郑州：郑州大学出版社，2011：170
[9] 高小龙，董远清，刘冬雪，等.碱液法浸提苏子叶中黄酮类化合物及含量测定[J].鞍山师范学院学报，2015（17）：93-95.
[10] 宋述芹，谷茂，陈飞鹏，等.固相微萃取气质联用分析罗勒花和叶的挥发性成分[J].质普学报，2008，29（2）：110-114.