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目的:本研究以Apo E-/-AS小鼠和RAW264.7巨噬细胞为研究对象,以巨噬细胞糖代谢重编程为主要切入点,探讨化瘀祛痰方通过调控以三羧酸循环(TCA)重置和磷酸戊糖途径(PPP)活化为特征的巨噬细胞糖代谢重编程,干预炎症反应进而发挥影响AS作用的分子机制。材料与方法:实验一:24只Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠随机分为模型组、化瘀祛痰方组、辛伐他汀组,给予高脂饲料喂养12周。8只C57BL/6J小鼠作为空白组,给予普通饲料喂养。化瘀祛痰方组与辛伐他汀组分别给予相应的药物灌胃,空白组与模型组给予等量的生理盐水。4周后采用全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量;采用苏木素-伊红(HE)染色观察主动脉斑块形态学改变;采用酶联免疫法(ELISA)检测各组小鼠血清中炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平;采用免疫荧光法观察主动脉巨噬细胞与脯氨酸羟化酶(PHD)、巨噬细胞与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)共定位情况;采用Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测主动脉炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的蛋白及m RNA表达;采用Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测Apo E-/-AS小鼠主动脉巨噬细胞糖代谢重编程—磷酸戊糖途径相关因子(G6PD、p38MAPK、NF-κB)的蛋白及m RNA表达;采用全自动蛋白质印迹定量分析系统(Wes)及实时荧光定量Q-PCR法检测主动脉巨噬细胞糖代谢重编程—三羧酸循环重置相关因子(SDH、PHD、HIF-1α)的蛋白及m RNA表达。实验二:RAW264.7巨噬细胞分为对照组、模型组(LPS诱导),空白含药血清组、化瘀祛痰方含药血清组、琥珀脱氢酶(SDH)抑制剂组(丙二酸二甲酯)、化瘀祛痰方含药血清干预琥珀酸脱氢酶抑制剂组。采用酶联免疫(ELISA)法检测对照组、模型组、空白含药血清组和化瘀祛痰方含药血清组炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)含量;琥珀酸(SA)试剂盒检测对照组、模型组、化瘀祛痰方含药血清组、丙二酸二甲酯组和化瘀祛痰方含药血清干预丙二酸二甲酯组的SA含量;采用Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测对照组、模型组、化瘀祛痰方含药血清组、丙二酸二甲酯组和化瘀祛痰方含药血清组干预丙二酸二甲酯组的巨噬细胞糖代谢重编程—三羧酸循环重置相关因子(SDH、PHD、HIF-1α)的蛋白及m RNA表达;采用酶联免疫(ELISA)法、Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测对照组、模型组、化瘀祛痰方含药血清组、丙二酸二甲酯组和化瘀祛痰方含药血清干预丙二酸二甲酯组炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量、蛋白及m RNA表达水平。实验三:RAW264.7巨噬细胞分为对照组、模型组(LPS诱导)、化瘀祛痰方含药血清组、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶抑制剂组(RRX-001)、化瘀祛痰方含药血清干预葡萄糖-6-磷酸脱氢酶抑制剂组。采用Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测对照组、模型组、化瘀祛痰方含药血清组、RRX-001组和化瘀祛痰方干预RRX-001组的巨噬细胞糖代谢重编程—磷酸戊糖途径活化相关因子(G6PD、p38MAPK、NF-κB)的蛋白及m RNA表达;采用酶联免疫(ELISA)、Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法法检测对照组、模型组、化瘀祛痰方含药血清组、RRX-001组和化瘀祛痰方含药血清干预RRx-001组炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)含量、蛋白及m RNA表达水平。结果:实验一:1.血脂水平:与空白组相比,模型组小鼠血清TC、TG和LDL-C含量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组小鼠血清TC、TG和LDL-C含量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.主动脉斑块病理:与空白组相比,模型组小鼠主动脉内膜增厚,管腔狭窄,大量粥样斑块形成;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组小鼠主动脉斑块较模型组明显减小。3.血清炎症水平:与空白组相比,模型组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著降低;差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。4.CD68与PHD、CD68与G6PD共定位:与空白组相比,模型组CD68与PHD共定位减少,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组均明显增强;与空白组相比,模型组CD68与G6PD共定位明显增多,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组均不同程度减低。5.主动脉炎症因子蛋白及m RNA表达:与空白相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α表达量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组IL-1β、IL-6、TNF-α表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。6.巨噬细胞糖代谢重编程—TCA重置相关因子蛋白及m RNA表达:与空白相比,模型组SDH、PHD相对表达量显著降低,HIF-1α表达量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组SDH、PHD表达量显著升高,HIF-1α表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。7.巨噬细胞糖代谢重编程—PPP活化相关因子蛋白及m RNA表达:与空白相比,模型组G6PD、p38MAPK、NF-κB表达量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方组及辛伐他汀组G6PD、p38MAPK、NF-κB表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。实验二:1.巨噬细胞炎症水平:与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著增高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。2.琥珀酸含量:与对照组相比,模型组SA含量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组SA含量显著降低;与模型组相比,丙二酸二甲酯组SA含量显著升高;与丙二酸二甲酯组相比,化瘀祛痰方含药血清干预丙二酸二甲酯组SA含量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。3.糖代谢重编程—TCA重置相关因子蛋白及m RNA表达:与对照组相比,模型组SDH、PHD相对表达量显著降低,HIF-1α相对表达量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组SDH、PHD相对表达量显著升高,HIF-1α相对表达量显著降低;与模型组相比,丙二酸二甲酯组SDH、PHD相对表达量显著降低,HIF-1α相对表达量显著升高;与丙二酸二甲酯组相比,化瘀祛痰方含药血清干预丙二酸二甲酯组SDH、PHD相对表达量显著升高,HIF-1α相对表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。4.糖代谢重编程—TCA重置炎症因子蛋白及m RNA表达:与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达量显著降低;与模型组相比,丙二酸二甲酯组IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA相对表达量显著升高;与丙二酸二甲酯相比,化瘀祛痰方含药血清干预丙二酸二甲酯组IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达显著降低;差异均有统计学意义(P<0.01)。实验三:1.糖代谢重编程—PPP活化相关因子蛋白及m RNA表达:与对照组相比,模型组G6PD、p38MAPK、NF-κB表达量显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组G6PD、p38MAPK、NF-κB表达量降低;与模型组相比,RRX-001组G6PD、p38MAPK、NF-κB表达显著降低;与RRX-001组相比,化瘀祛痰方含药血清干预RRX-001组G6PD、p38MAPK、NF-κB m RNA相对表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.糖代谢重编程—PPP活化炎症因子蛋白及m RNA表达:与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著升高;与模型组相比,化瘀祛痰方含药血清组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低;与模型组相比,RRX-001组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低;与RRX-001组相比,化瘀祛痰方含药血清干预RRX-001组IL-1β、IL-6、TNF-α相对表达量显著降低;差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:1.化瘀祛痰方通过纠正血脂紊乱、减少主动脉斑块形成、干预炎症反应,发挥抗AS的作用。2.化瘀祛痰方通过调控SA-PHD-HIF-1α通路和G6PD-p38MAPK/NF-κB通路,纠正三羧酸循环重置,抑制磷酸戊糖途径活化,干预炎症反应进而发挥抗AS作用。