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甲状腺癌(thyroid carcinoma,TC)发病率约占全身恶性肿瘤的3%,居内分泌系统恶性肿瘤之首,也是近年来增长最快的恶性肿瘤之一,甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma,PTC)检出率增高是TC增速较快的主要原因。因此,探索与PTC发生发展相关的生物学标志物及预后评价指标有重要意义。MicroRNA(miRNA)是一类长度在18至22个核苷酸的非编码单链RNA分子。随着精准医疗的深入研究,探讨miRNA与基因相互调节机制对PTC的诊治具有良好的前景。课题组前期研究发现,PTC组织中存在TFF3的高表达,本项目进一步探索调控TFF3表达的miRNAs及作用机制,将并为PTC的治疗提供潜在的靶点。首先,利用生物信息学网站预测可能调控TFF3的miRNAs为miR-7-5p和miR-143-3p;通过实时荧光定量PCR反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析PTC组织和癌旁正常组织中miR-7-5p和miR-143-3p差异性表达,并进一步分析其与PTC患者的临床病理特征(如年龄,性别,临床分期,肿瘤大小和淋巴结转移)的相关性。然后,以甲状腺乳头状癌TPC-1细胞系为研究对象,分为三组:实验组:通过转染miR-7-5p mimics和miR-143-3p mimics分别使TPC-1细胞中miR-7-5p和miR-143-3p过表达,得到miR-7-5p/miR-143-3p高表达的mimics-7-5p组/mimics-143-3p组;阴性对照组转染相应的mimics-NC;空白对照组(未经任何处理的TPC-1细胞)。分别将合成的miR-7-5p mimics和miR-143-3p mimics及阴性对照与携带有野生型和突变型TFF3报告基因质粒共转染至TPC-1细胞,进行双荧光素酶报告基因实验验证两个miRNA与TFF3的靶向关系,western blot实验同时验证mimics-7-5p组/mimics-143-3p组以及相应的阴性对照mimics-NC组、空白对照组TFF3的表达情况;利用细胞生长曲线、划痕试验和Transwell实验分别检测miR-7-5p和miR-143-3p对TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。最后,通过western blot和免疫细胞化学染色法检测过表达miR-7-5p和miR-143-3p后对TPC-1细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物(E-cadherin,N-cadherin和Vimentin)的变化。结果显示:(1)生物信息学分析筛选出可能调控TFF3的靶miRNAs为miR-7-5p和miR-143-3p。(2)与癌旁正常组织相比,PTC中miR-7-5p和miR-143-3p表达明显降低,表达水平分别为癌旁组织的0.6倍和0.47倍,差别具有统计学意义(P<0.01或P<0.01);(3)miR-7-5p和miR-143-3p的表达水平与PTC患者的临床病理特征之间的关系:miR-7-5p和miR-143-3p的低表达与临床分期,肿瘤大小存在相关性(P<0.01),与患者的年龄、性别无相关性(P>0.05);miR-7-5p表达水平降低与淋巴结转移者表现出相关性,miR-143-3p则表现出与淋巴结转移无关。(4)为探讨miR-7-5p和miR-143-3p在PTC中的作用,RT-qPCR显示三株PTC细胞系(TPC-1、BCPAP、K1)中miR-7-5p和miR-143-3p的表达水平明显低于正常甲状腺Nthy-ori 3-1细胞,而TPC-1细胞中miR-7-5p和miR-143-3p的表达水平最低(P<0.01)。(5)双荧光素酶报告基因实验结果:miR-7-5p/miR-143-3p与携带野生型TFF3报告基因质粒共转染后荧光素酶强度显著降低(P<0.01),而与缺失靶位点的突变型TFF3报告基因质粒共转染后荧光素酶强度无明显变化。说明miR-7-5p和miR-143-3p能够特异性靶向结合TFF3的3’UTR区。(6)生长曲线表明自第1天开始,mimics-7-5p和mimics-143-3p的实验组细胞增长明显滞后于阴性对照组和空白对照组,增殖能力明显降低(P<0.05或P<0.01);而阴性对照组与空白对照组细胞增殖能力无统计学差异。(7)细胞划痕实验结果显示:mimics-7-5p和mimics-143-3p实验组细胞迁移率明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05或P<0.01),而阴性对照组和空白对照组细胞迁移能力无统计学差异。(8)小室侵袭实验结果显示:与阴性对照组和空白对照组相比,mimics-7-5p和mimics-143-3p实验组细胞侵袭数目明显减少(P<0.05或P<0.01),说明mimics-7-5p组和mimics-143-3p组能够明显抑制TPC-1细胞的侵袭;而阴性对照组和空白对照组细胞侵袭能力无统计学差异。(9)Western blot和免疫细胞化学结果显示mimics-7-5p和mimics-143-3p实验组EMT指标N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平下降,E-cadherin蛋白表达水平增强(P<0.05);阴性对照组和空白对照组组EMT相关蛋白水平无统计学差异。结论:(1)人PTC组织miR-7-5p、miR-143-3p低表达。(2)miR-7-5p和miR-143-3p可以通过靶向TFF3抑制TPC-1细胞的上皮-间质转化过程,降低TPC-1细胞的增殖,迁移和侵袭能力。