miRNA组合作为口腔鳞癌预后模型的构建及miRNA-548K促进肿瘤进展的作用研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qhjxiaofeitian
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作为全球位居第6位的恶性肿瘤,口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是当今口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。深入探索OSCC诊断及预后的生物学标记物以及加强研究OSCC发生进展的机制对改善患者预后具有重要意义。非编码微小RNA(micro RNA,简写为miRNA)在恶性肿瘤中的作用受到越来越多学者的高度关注和广泛研究。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库是肿瘤研究中具有跨时代意义的重要数据库,它储存了包括口腔鳞状细胞癌在内的一共33种肿瘤基因转录组的高通量测序数据以及患者相应的临床特征及预后信息。据此可建立基于miRNA表达情况的肿瘤患者生存分析,寻找与OSCC患者生存预后存在相关关系的特定miRNA组合。进一步通过实验研究分析相关miRNA在OSCC肿瘤细胞的增殖、侵袭等过程中发挥重要作用。目的:通过构建以miRNA组合为基础的预后模型来预测头颈部鳞癌患者的生存时间。分析相关miRNA在OSCC患者中影响疾病进展的作用。方法:利用TCGA数据库获取头颈部鳞癌患者的miRNAs表达数据及相关的临床资料,构建基于miRNA表达量的生存预后模型。选定显著影响OSCC患者预后的miRNA作为研究对象。采用实时定量PCR(q RT-PCR)技术验证miRNA-548k在肿瘤标本和相应癌旁组织中表达水平;利用miRNA-548k模拟物以及miRNA-548k抑制物进行细胞功能实验,与对照组相比初步判断miRNA-548k对OSCC细胞增殖、侵袭的影响;采用生物信息学分析方法寻找与miRNA-548k相关的可能下游靶点;在此基础上,我们使用双荧光素酶报告基因实验对下游靶基因进行确认;最后针对下游靶基因设计相关si RNA进行拯救回复实验进一步论证miRNA-548k通过该靶基因发挥生物学功能;为了进一步验证miRNA-548k在小鼠体内实验中发挥的作用,应用人源OSCC组织构建了小鼠PDX模型,观察注射miRNA-548k组小鼠较阴性对照组肿瘤体积的大小。结果:通过对比TCGA数据库中头颈部鳞癌组织与正常组织miRNA表达情况发现,140个miRNAs在肿瘤及正常对照组织中存在显著差异。LASSO-Cox回归分析确立了7个miRNAs(hsa-miR-499a,hsa-miR-548k,hsa-miR-3619,hsa-miR-99a,hsa-miR-137,hsa-miR-3170,and hsa-miR-654)组合作为头颈部鳞癌的预后模型。根据这些miRNA的表达情况,建立风险评分模型,评分方法按照下列公式:风险评分=表达值(miR-499)×0.21+表达值(miR-548k)×0.264-表达值(miR-3619)×0.404-表达值(miR-99)×0.367+表达值(miR-137)×0.123+表达值(miR-3170)×0.298+表达值(miR-654)×0.222。进一步通过时间依赖性受试者曲线验证了该模型的预测能力,提示该miRNA模型对头颈部鳞癌患者生存预后的评估具有较好的准确性及稳定性。miRNA-548k在口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织中高表达,与癌旁组织具有显著差异。在体内外实验中miRNA-548k模拟物促进肿瘤的增殖、侵袭,miRNA-548k抑制物抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力。生物信息学分析得出Lin-7C可能是miRNA-548k下游靶基因之一。进一步实验结果发现,OSCC肿瘤组织和细胞株中的miRNA-548k与Lin-7C的表达成负相关关系,荧光报告基因实验证实两者间的直接作用关系。拯救回复实验结果证实miRNA-548k部分通过调控Lin-7C发挥促肿瘤增殖、侵袭的作用。通过PDX模型的动物实验发现,miRNA-548k模拟物能够促进肿瘤组织的生长。结论:(1)由7个miRNAs的表达量构成的头颈部鳞癌的预后模型具有较高的敏感性、特异性以及时间依赖的稳定性,能够比较准确预测头颈部鳞癌患者总体生存时间。(2)通过抑制Lin-7C的表达,miRNA-548k可促进OSCC的增殖和侵袭。(3)miRNA-548/Lin-7C通路可能成为治疗OSCC的一个新靶点。
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