缺血性脑卒中是一种高致死率和高致残率疾病,严重危害人类健康。目前临床针对该类疾病的有效而且唯一的治疗措施就是使用组织型纤溶酶原激活剂（the tissue plasminogen activtor,tPA）对脑缺血病人进行溶栓治疗。但是,该疗法具有严格的时间窗（脑缺血发生4.5 h内治疗）限制,而且脑缺血病人接受tPA治疗,会带来缺血后出血的风险。由于种种条件的限制,仅仅约6%的病人能够接受tPA治疗,大部分脑卒中病人仅仅接受一些简单的医院护理治疗。因此,寻找新的脑卒中治疗靶点,设计药物,使大部分无法接受tPA溶栓疗法的脑卒中患者获得治疗,具有重要意义。神经保护剂的研究给脑卒中治疗提供了新的思路。但是,在过去20多年的研究进程中,很多在临床前研究中展示较好效果的神经保护剂在临床上并没有展示良好的疗效。治疗时间窗窄、作用靶点单一、忽略了恢复期的结构重塑等原因很可能是神经保护剂向临床转化失败的主要原因。因为脑缺血后期缺血半影区会发生一系列错综复杂的病理生理过程,如炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、突触可塑性相关的神经环路重构等。表观遗传学是研究在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传变化的学科。组蛋白脱乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）是表观遗传学研究过程中的关键蛋白酶家族,该酶调控基因的表达进而改变细胞内的信号转导,介导一系列生物学过程,如突触可塑性、细胞存活、神经炎症、氧化应激等。在组蛋白脱乙酰化酶的催化作用下,组蛋白上的乙酰基被脱去,染色质变得紧缩,从而抑制一系列基因的转录、表达。虽然有文献报道在脑缺血急性期使用HDACs抑制剂具有缺血保护作用,但是HDACs是否在缺血后期扮演重要角色迄今未见研究报道。在本研究中,我们探讨以下问题:（1）脑缺血后是否存在功能损伤修复时间窗以及以表观遗传学为靶标的脑卒中治疗策略研究;（2）以表观遗传学为靶标促进脑缺血后功能修复的机理探讨。第一章HDAC2调控脑缺血后运动功能损伤修复时间窗为了探究脑缺血后是否存在功能损伤修复时间窗,本研究制备了小鼠光照致大脑缺血模型（Photothrombotic stroke）,于造模后1-14 d期间每天同一时间段测定网格和圆桶实验,评价小鼠造模后运动功能变化。结果显示,与造模后1 d相比,小鼠造模后2-4 d的运动功能有所恢复;然而与造模后3 d相比,小鼠造模后5-7 d的运动功能进一步损伤。同时,我们发现小鼠造模后8 d开始,其运动功能逐渐向好的方向修复。以上实验说明,小鼠光照致脑缺血造模后5-7d是运动功能损伤修复的时间窗。我们推测表观遗传学机制可能介导了小鼠光照致脑缺血造模后5-7 d运动功能损伤修复时间窗的病理生理过程。为了验证以上猜想,本研究在小鼠光照致脑缺血造模后1,3,7,14 d四个时间点提取了缺血半影区脑组织进行生化检测组蛋白乙酰化水平,结果显示脑缺血造模后缺血半影区脑组织组蛋白H3和H4乙酰化水平显著低于假手术组,而且在造模后第7 d达到最低。这提示表观遗传学机制参与了小鼠光照致脑缺血造模后运动功能损伤修复时间窗的病理生理过程。组蛋白乙酰化水平改变,同时接受组蛋白乙酰基转移酶（Histone acetyltransferase,HAT）和HDAC调控。运动功能损伤修复时间窗内组蛋白乙酰化水平降低,很可能是HATs活性降低,HDACs活性增加导致的,或者两个酶共同发挥作用。本研究关注HDACs在运动功能损伤修复时间窗内扮演的角色。为了验证HDACs是否介导了小鼠光照致脑缺血造模后5-7 d运动功能损伤修复时间窗的病理生理过程。本研究通过微量给药系统分别于光照致小鼠脑缺血造模后2-4 d、5-7 d、8-10 d给予TSA（HDAC非选择性抑制剂）至缺血半影区,分别于造模前3d和末次给药后24h测定网格和圆桶,评价其运动功能。结果表明,不同时间段在缺血半影区给予TSA均能显著增加缺血半影区的组蛋白乙酰化水平,说明不同时间段给予TSA均能发挥药效。行为学结果表明,只有在5-7 d这个时间窗内给予TSA能够显著改善缺血后运动功能障碍,而在2-4 d或8-10 d给予TSA均不能显著改善缺血后运动障碍。以上结果表明,HDACs介导了小鼠光照致脑缺血造模后5-7 d运动功能损伤修复时间窗的病理生理过程。根据与酵母原始酶的序列同源性以及功能域组成不同,哺乳动物中表达的18种组蛋白脱乙酰化酶分成以下四类:第Ⅰ类包含HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8,第Ⅱ类分为两小类,a类HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9,b类HDAC6、HDAC10,第Ⅲ类由Sirturins1-7组成和第Ⅳ类HDAC11。那么,HDACs家族中所有的HDACs都参与缺血后的损伤修复过程?还是哪一类HDACs参与该过程?或者更加具体的是哪一个HDAC介导了脑缺血后损伤修复时间窗?为了回答以上问题,我们在脑缺血后5-7 d这个损伤修复时间窗内通过微量给药系统分别给予MGCD0103（HDAC 1,HDAC2,HDAC3选择性抑制剂）和TMP269（HDAC4,HDAC5,HDAC7,HDAC9选择性抑制剂）,于末次给药后24 h测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,只有MGCD0103能够显著改善脑缺血后运动功能,而TMP269对脑缺血后运动功能没有影响。为了进一步验证MGCD0103改善脑缺血后运动功能的作用,本研究制备了大鼠MCAO（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,并于造模后5-7 d腹腔给予MGCD0103,末次给药24h后测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,与MGCD0103改善小鼠光照缺血模型损伤修复时间窗的运动功能一致,MGCD0103同样能够显著改善大鼠MCAO模型损伤修复时间窗的运动功能。上述结果表明,HDACs家族中的Ⅰ类HDACs介导了脑缺血后损伤修复时间窗的病理过程。为了进一步探究Ⅰ类HDACs中哪几个还是具体哪一个HDAC介导脑缺血后损伤修复时间窗的病理过程,本研究在脑缺血后5-7 d这个损伤修复时间窗内通过微量给药系统给予SAHA（HDAC1和HDAC2选择性抑制剂）,末次给药24 h后测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,SAHA能够显著改善脑缺血后运动功能二次损伤时间窗内的运动功能。以上结果表明,Ⅰ类HDACs中的HDAC1和HDAC2介导了脑缺血后运动功能二次损伤时间窗的病理过程。查阅文献发现,HDAC2逆向调控神经元存活和突触可塑性,而HDAC1正向调控缺血保护。因此,我们推测HDACs家族中的HDAC2很可能是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子。为了验证我们的猜想,本研究构建了HDAC2flox/flox鼠和AAV-CAG-EGFP-Cre及其对照病毒AAV-CAG-EGFP。小鼠光照致脑缺血造模后即刻注射腺相关病毒,感染缺血半影区脑组织,在Cre重组酶的作用下,切割LoxP位点,从而实现HDAC2敲减的目的。结果显示,与HDAC2flox/flox鼠光照致脑缺血造模后给予AAV-CAG-EGFP相比,造模后给予AAV-CAG-EGFP-Cre显著改善了造模后8 d的运动功能。以上实验说明,HDAC2是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子。为了进一步验证HDAC2在脑缺血后运动功能二次损伤过程中所扮演的重要角色,本研究构建了HDAC2过表达病毒Ad-HDAC2-Flag,及其对照病毒HDAC2无活性过表达病毒Ad-inactive-HDAC2-Flag。小鼠光照致脑缺血造模后即刻注射腺病毒,感染半影区脑组织,从而上调缺血半暗带的HDAC2活性。结果显示,与光照致脑缺血造模后给予Ad-inactive-HDAC2-Flag相比,造模后给予Ad-HDAC2-Flag组造模后8 d运动功能进一步恶化。以上实验与HDAC2敲减实验一致共同说明,HDAC2是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子。为了进一步确证HDAC2是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子。本研究将HDAC2flox/flox鼠与EMX1-Cre转基因鼠进行杂交,得到了皮层兴奋性神经元特异性敲除HDAC2鼠HDAC2flox/flox-EMX1-Cre。野生型对照HDAC2flox/flox鼠和HDAC2flox/flox-EMX1-Cre鼠同时进行光照造模,分别分成以下3组（Sham,Stroke+Vehicle,Stroke+TSA）,给药时间段为缺血后5-7 d。结果显示,与野生型造模组相比,HDAC2flox/flox-EMX1-Cre造模组,造模后8d的运动功能显著得到改善。同时,我们发现TSA能够显著改善野生型造模鼠二次运动损伤时间窗的运动功能,而对HDAC2flox/flox-EMX1-Cre无效。进一步的研究表明,HDAC2过表达会进一步恶化HDAC2flox/flox-EMX1-Cre鼠脑缺血后的运动功能。说明与野生型鼠相比,HDAC2flox/flox-EMX1-Cre鼠脑缺血后运动功能改善是HDAC2敲除所带来的效应。以上实验结果表明,HDAC2是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子。上述实验证明了HDAC2逆向调控脑缺血后运动功能损伤修复时间窗内的运动功能,那么在该时间窗操纵HDAC2是否对脑缺血后运动功能修复具有持久效应呢?为了探究以上问题,本研究制备了小鼠光照致脑缺血模型,于造模后5-7 d通过微量给药系统给予MGCD0103,分别在造模后11 d、18 d和25 d测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。实验结果显示,在脑缺血后运动功能损伤修复时间窗内给予Ⅰ类HDACs抑制剂,能够显著持久地促进脑缺血后运动功能修复。为了进一步确证在二次损伤修复时间窗内操纵HDAC2对脑缺血后运动功能修复的持久效应,本研究构建了一种慢病毒载体,携带HDAC2-shRNA-GFP以干扰HDAC2表达。慢病毒载体携带GFP作为其对照病毒。小鼠光照致脑缺血造模后即刻注射慢病毒,感染缺血半影区脑组织,从而敲减缺血半暗带的HDAC2水平。分别在造模后11d、18 d和25 d测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,与光照致脑缺血造模后给予LV-GFP相比,造模后给予LV-shHDAC2-GFP显著持久地促进脑缺血后运动功能修复。以上实验结果,与在缺血后5-7 d时间窗内给予Ⅰ类HDACs抑制剂一致说明,在缺血后损伤修复时间窗抑制HDAC2显著持久地促进脑缺血后功能修复。在缺血后损伤修复时间窗内抑制HDAC2的活性或者下调HDAC2的表达,均能够带来促进缺血后行为持久修复的功效。那么,在该时间窗内过表达HDAC2是否会长久进一步恶化脑缺血后运动功能损伤呢?为了探究这个问题,本研究在小鼠光照致脑缺血造模后即刻分别注射HDAC2过表达病毒Ad-HDAC2-Flag或HDAC2无活性对照病毒Ad-inactive-HDAC2-F lag,并于造模后11 d,、18 d和25 d测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,与光照致脑缺血造模后给予Ad-inactive-HDAC2-Flag相比,造模后给予Ad-HDAC2-Flag显著持久地进一步恶化脑缺血后运动功能损伤。以上实验结果表明,在脑缺血损伤修复时间窗内过表达HDAC2会导致脑缺血后运动功能损伤进一步恶化。为了进一步确证是HDAC2这个分子逆向调控了脑缺血后运动功能损伤修复时间窗内的运动功能,并且这种调控效应持久存在。本研究将HDAC2flox/flox鼠与Nestin-Cre转基因鼠进行杂交,得到了神经系统特异性HDAC2敲除鼠HDAC2flox/flox-Nestin-Cre。野生型对照HDAC2flox/flox鼠和HDAC2flox/flox-NestinCre鼠同时进行光照造模,分别分成以下3组（Sham,Stroke+Vehicle,Stroke+TSA）,给药时间段为缺血后5-7 d。分别于造模后11d、18d和25 d测定网格和圆桶实验,评价其运动功能。结果显示,与野生型造模组相比,HDAC2flox/flox-Nestin-Cre造模组,造模后运动功能显著持久得到改善。同时,我们发现TSA能够显著持久地改善野生型造模鼠缺血后的运动功能,而对HDAC2flox/flox-Nestin-Cre鼠无效。第二章MGCD0103打开脑缺血损伤修复时间窗的机制本章研究主要探讨Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103打开脑缺血损伤修复时间窗的分子,组织形态及电生理功能机制。首先,我们探讨了脑缺血后损伤修复时间窗内HDAC2的表达和活性变化。结果显示,与假手术组相比,缺血后7 d缺血半影区的HDAC2表达水平和活性均显著增加。为了进一步探讨脑缺血后导致缺血半影区HDAC2表达和活性增加的因素,我们进行了一系列体外细胞模拟实验。结果显示,脑缺血后期的氧化应激以及炎症反应是导致缺血半影区HDAC2表达增加的原因,而NMDA介导的兴奋性毒性作用对HDAC2表达没有影响。脑缺血后梗死体积的减少是导致运动功能改善最直接的作用,那么在脑缺血运动功能二次损伤时间窗内使用Ⅰ类HDACs抑制剂,是否通过减少缺血后梗死体积达到促进缺血后运动功能修复的功效呢?为了探究这个科学问题,我们制备了小鼠光照致脑缺血和大鼠MCAO两个脑缺血模型,在缺血后5-7 d分别通过留置管和腹腔给予MGCD0103,24 h后分别进行尼氏和TTC染色。结果显示,在光照致脑缺血和MCAO两种不同的脑缺血模型下,MGCD0103对梗死体积均没有影响。以上实验表明,在脑缺血运动功能二次损伤时间窗内Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103不是通过减少梗死体积促进缺血后运动功能修复的。为了探讨在脑缺血运动功能二次损伤时间窗内使用Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103促进运动功能修复的分子机理,我们提取了小鼠光照致缺血造模5-7 d分别给予MGCD0103和溶剂组的半影区以及假手术对应脑区的组织样本,进行了RNA-Sequencing分析。结果显示,造模后给予MGCD0103组和造模后给予溶剂组相比共有1 148差异表达的基因,其中417个基因为上调差异基因（Stroke+MGCD0 103 vs Stroke+Vehicle）,731个基因为下调差异基因（Stroke+MGCD0103 vs Stroke+Vehicle）。通过这些差异基因进行信号通路分析,发现这些差异基因主要参与炎症反应,超氧阴离子生成和突触可塑性等生物学过程。缺血半影区的突触可塑性增强能够带来该区域的结构重塑,最终促进损伤修复。对基因芯片结果的进一步分析,我们发现突触可塑性相关正向调控基因Noval,Unc5c和Discl,与溶剂组相比,造模后给予MGCD0103显著上调;而突触可塑性相关负向调控基因Bestrophin 1,与溶剂组相比,造模后给予MGCD0103显著下调。为了进一步确证基因芯片的结果,我们进行了Westernblot生化检测对以上基因进行了蛋白水平的验证。结果表明,蛋白水平的变化趋势与基因芯片的结果一致。造模后给予MGCD0103显著上调Noval,Unc5c和Disc1的表达很可能是MGCD0103抑制HDAC活性促进组蛋白乙酰化水平增加的直接作用导致的。为了验证以上猜想,本研究提取了小鼠光照致缺血造模5-7 d分别给予MGCD0103和溶剂组的半影区以及假手术对应脑区的组织样本,进行了染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）分析。结果表明,脑缺血造模后Noval,Unc5c和Disc1这些突触可塑性相关正向调控基因的启动子区域乙酰化H4水平显著降低,而MGCD0103能够逆转缺血导致的Noval,Unc5c和Disc1启动子区域乙酰化H4水平降低。以上结果从分子水平验证了脑缺血后二次损伤时间窗内给予MGCD0103促进突触可塑性相关正向调控基因的表达,同时抑制突触可塑性相关负向调控基因的表达,这是MGCD0103促进脑缺血损伤修复的有力证据。那么组织结构方面,是否具有一致的结果呢?为了探讨以上问题,本研究制备了小鼠光照致脑缺血模型,并于造模后5-7 d分别给予MGCD0103和溶剂,末次给药24 h后分离缺血半脑脑组织进行Golgi染色,分析缺血半影区存活神经元的树突和树突棘等结构。实验结果表明,脑缺血显著下调了缺血半影区存活神经元的树突棘密度,树突长度和分支数,造模后5-7 d给予MGCD0103能够显著逆转缺血导致的神经元树突棘密度,树突长度和分支数下调。以上数据表明,在脑缺血后二次损伤时间窗内使用Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103能够显著增强缺血半影区存活神经元的结构可塑性。树突和树突棘结构的变化是否会带来电生理功能的改变?为了探究这个问题,本研究选取缺血半影区的存活神经元或假手术对应脑区神经元进行全细胞记录mEPSCs。实验结果显示,与缺血后二次损伤时间窗内给予MGCD0103逆转缺血诱导的神经元树突棘丢失,树突长度和分支数减少等形态学结果一致,缺血后5-7d给予MGCD0103显著逆转了缺血导致的缺血半影区存活神经元mEPSCs频率的降低,而各组别间mEPSCs幅度没有显著差异。以上结果表明,缺血后二次损伤时间窗内给予Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103不仅增强了缺血半影区存活神经的结构可塑性,同时能够增强功能可塑性,这是MGCD0103促进脑缺血损伤修复的有力证据。缺血半影区兴奋性与抑制性神经通路的平衡对脑缺血功能修复也起到了至关重要的作用。基因芯片的结果表明,脑缺血后5-7 d给予MGCD0103能够显著逆转脑缺血导致Bestrophin1上调。Bestrophin 1是介导GABA tonic inhibition的关键通道蛋白。那么,MGCD0103是否通过下调Bestrophin 1的表达,减少缺血半影区神经元的GABA tonic inhibition,最终促进缺血后功能修复呢?为了探究以上科学问题,本研究制备了小鼠光照致缺血模型,5-7 d分别给予MGCD0103和溶剂组,末次给药24 h后进行缺血半影区微透析结合LC-MS/MS分析,检测缺血半影区脑组织的细胞间隙神经递质浓度。结果显示,脑缺血后缺血半影区细胞间隙兴奋性神经递质Glutamate以及抑制性神经递质GABA均显著上调,MGCD0103能够显著逆转缺血诱导的细胞间隙抑制性神经递质GABA增加,而对兴奋性神经递质Glutamate没有影响。细胞间隙GABA浓度的增加,会导致细胞GABA tonic inhibition增加,最终下调细胞及神经环路的兴奋性。那么,MGCD0103逆转缺血诱导的细胞间隙抑制性神经递质GABA增加的效应,在电生理记录中是否表现为逆转缺血后缺血半影区神经元的GABA tonic inhibition增加呢?为了探究以上问题,本研究选取了不同组别脑缺血后8d缺血半影区存活神经元进行了全细胞记录。实验结果显示,脑缺血后5-7 d通过留置针在缺血半影区局部给予MGCD0103显著逆转了缺血诱导的GABA tonic inhibition电流增加。同时,我们发现MGCD0103对phasic inhibitory电流,静息膜电位以及GABA翻转电位均没有影响。以上结果表明,在缺血损伤修复时间窗内使用Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103能够显著逆转缺血诱导的GABA tonic inhibition电流增加,增强缺血半影区的功能可塑性,从而促进缺血后功能修复。基因芯片结果提示,在缺血后二次损伤时间窗内使用MGCD0103能够减少脑缺血后炎症反应,为了进一步确证MGCD0103对炎症反应的影响,本研究进行了免疫组织化学和Western blot生化检测。实验结果显示,在缺血后二次损伤时间窗内使用MGCD0103能够显著逆转脑缺血诱导的缺血半影区阿米巴样小胶质细胞的数量以及缺血导致的半影区神经元丢失。进一步的生化检测结果显示,与免疫组化结果相一致,MGCD0103能够显著上调促细胞存活因子BDNF的表达,同时显著下调炎症因子TNFα和IL-1β的表达。以上结果表明,在缺血后二次损伤时间窗内使用MGCD0103减少缺血半影区炎症反应,促进缺血半影区神经元存活,最终改善缺血后运动功能。综合以上结果可得到如下结论:（1）脑缺血后5-7d为脑缺血二次损伤时间窗。（2）HDAC2是调控脑缺血后运动功能二次损伤的关键分子,而且在运动功能损伤修复时间窗内干预HDAC2对行为学的调控作用持久存在。（3）在脑缺血二次损伤时间窗内使用Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103增强了缺血半影区的突触可塑性,减少了半影区的炎症反应,促进了缺血半影区的神经元存活,以上机制共同介导了脑缺血后运动功能修复。