背景及研究目的：顺铂是一种高效的化疗药，在临床上被广泛用于抗肿瘤治疗，包括生殖细胞肿瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌及睾丸癌等[1]。然而，该药也存在许多不良反应，如耳毒性、肾毒性、神经毒性等。在使用顺铂化疗的病人中，高达93%的患者可以出现感音神经性聋[2]，对于顺铂造成的耳毒性，目前尚无有效的治疗方法。因此，对于顺铂造成的耳毒性机制研究十分重要。有研究发现顺铂进入耳蜗后首先被毛细胞摄取，而支持细胞摄取顺铂的能力相对较弱[3]，这就提示毛细胞可能是听功能损伤的主要靶细胞。内耳毛细胞是真正的感觉细胞，它将声音信息传递到中枢神经系统。内毛细胞突触是一种感觉信息损失最小的模拟系统[4]，具有亚毫秒级的精确度并且具有最高效率的囊泡释放和回收的特点。内毛细胞与传入神经末梢构成特殊的带状突触，otoferlin蛋白是内毛细胞带状突触上的功能蛋白，可以与synaptotagminI(突触结合蛋白I)、胞浆磷脂酶A2、Ras相关的GTP结合蛋白等结合，它在胞膜运输、信号传递及递质释放等方面起着重要作用[5]。有研究表明在成熟小鼠耳蜗中该蛋白仅在内毛细胞中高表达[6]，被认为是Ca2+感受器，与内毛细胞胞吐过程密切相关，它的损伤可导致听觉功能下降。目前顺铂对听功能损伤的具体机制尚不明确，主要存在两种假说：一种假说认为顺铂作为一种高反应性分子，一旦进入内耳细胞就可以通过水合反应转化为更有活性的水分子形式结合许多生物大分子，如RNA、蛋白、膜磷脂、微丝及DNA等，进而造成听力的损伤[7]。另一种假说认为，顺铂进入耳蜗细胞后，可激发产生大量的自由基[1]，这些自由基增多可引起毛细胞内钙离子浓度增高并导致毛细胞凋亡。以往的实验主要研究顺铂对外毛细胞、螺旋神经节细胞的损伤，但是针对顺铂对内毛细胞损伤的研究较少。本实验主要研究顺铂尤其是低剂量顺铂对听功能的损伤，以及其损伤是否与内毛细胞本身及其功能蛋白otoferlin有关。因此，本研究内容是建立低剂量顺铂听觉损伤模型，观察内毛细胞形态变化及otoferlin蛋白的表达情况，丰富顺铂造成听功能损伤的机制，并为临床防护顺铂对听功能的损伤提供新的实验证据。同时为后续进一步研究otoferlin蛋白调节机制提供损伤模型。方法：1、将雄性C57小鼠(8周-12周龄)随机分为7组，每组8只。分别为第一组：正常对照组，其余各组腹腔注射顺铂。第二组：顺铂的剂量为0.75mg/(kg×d)，连续注射4d；第三组：注射剂量为1.5mg/(kg×d)，连续注射4d；第四组：注射剂量为3.0mg/(kg×d)，连续注射4d；第五组：注射剂量为0.75mg/(kg×d)，连续注射7d；第六组：注射剂量为1.5mg/(kg×d)，连续注射7d；第七组：注射剂量为3.0mg/(kg×d)，连续注射7d。2、小鼠听性脑干反应(ABR)阈值测定：用药结束后对各组小鼠听阈进行测定，使用SPSS18.0软件，采用t检验和单因素方差分析所得听阈值，P＜0.05具有统计学意义；3、内毛细胞形态学观察：利用5%AgNO3耳蜗基底膜染色，于光学显微镜下观察内毛细胞形态变化，分别在不同剂量和不同时间点进行对比；4、采用免疫荧光法、RT-PCR测定基底膜内毛细胞otoferlin蛋白的表达，检测顺铂对耳蜗内毛细胞otoferlin蛋白表达的影响。结果：1、听功能情况(ABR阈值)：同一时间对比中，用药4天的实验组与正常组比较，1.5mg/kg组和3.0mg/kg组存在明显差异(P＜0.05)，且随着剂量的增加，阈值增高越明显；用药7天的实验组与正常组相比听力均明显下降(P＜0.05)，0.75mg/kg组和1.5mg/kg组平均值相同，3.0mg/kg组较前两组阈值增高。同一剂量的情况下，0.75mg/kg×7d组比0.75mg/kg×4d组损伤更重(P＜0.05)，其余剂量造成的损伤在不同时间点无明显差异。2、内毛细胞AgNO3染色：正常小鼠内毛细胞呈圆形，大小均一，细胞间隙清楚，胞膜表面光滑，可观察到呈“一”字型的纤毛；0.75mg/kg×4d组内毛细胞呈椭圆形，大小无明显改变，细胞间隙清楚，胞膜表面光滑，未见纤毛结构；1.5mg/kg×4d组内毛细胞呈椭圆形，大小无明显改变，细胞间隙缩小，胞膜不光滑，未见纤毛结构；3.0mg/kg×4d组内毛细胞呈椭圆形，体积明显减小，细胞间隙缩小，细胞膜皱缩，未见纤毛结构；0.75mg/kg×7d组内毛细胞呈椭圆形，体积稍有减小，细胞间隙缩小，胞膜皱缩，未见纤毛结构；1.5mg/kg×7d组内毛细胞细胞呈椭圆形，体积缩小，细胞间隙不清，胞膜无法辨认，未见纤毛结构；3.0mg/kg×7d组内毛细胞细胞呈圆形，体积明显缩小，细胞间隙明显增宽，胞膜无法辨认。3、otoferlin蛋白免疫荧光染色：正常小鼠内毛细胞otoferlin绿色荧光表达均一完整，。随着用药剂量和时间的增加，otoferlin蛋白发生相应的改变，但DAPI标记的细胞核仍存在，即内毛细胞未缺失。其中第7组(3.0mg/kg×7d)较正常组蛋白荧光灰度值明显降低，即表达量明显降低，其余各组无明显区别，第3组(1.5mg/kg×4d)灰度值和第6组(1.5mg/kg×7d)较其他用药组明显升高。4、otoferlin RT-PCR：0.75mg/kg与3.0mg/kg实验组相比，RNA表达量均下降；而1.5mg/kg实验组无明显下降，余各实验组之间无统计学差异。结论：1、成功建立了稳定的低剂量顺铂损伤听功能小鼠模型，发现顺铂损伤听功能与时间和剂量相关，随着用药时间和剂量的增加，小鼠的听力损伤逐渐加重；但0.75mg/(kg×d)×7d组和1.5mg/(kg×d)×7d组ABR阈值改变相同，考虑在一定损伤条件下可能会激发小鼠耳蜗自我保护功能；2、顺铂可以造成内毛细胞形态上不同程度的损伤；3、免疫荧光图片发现，顺铂可以造成otoferlin蛋白表达改变。随剂量和时间不同，otoferlin蛋白表达亦不同，蛋白表达的变化与内毛细胞形态改变并非同步关系。4、综上所述，顺铂造成的听功能损伤与内毛细胞有关，其损伤程度和剂量、时间呈相关性，即损伤越重内毛细胞形态学改变越明显；顺铂造成的听功能损伤可能与内毛细胞突触蛋白otoferlin有关，但其损伤程度和剂量、时间不成正比性，并且和内毛细胞形态学非同步性损伤。考虑其原因可能是由于内毛细胞中储存的mRNA在顺铂的刺激下，增加了蛋白质的合成，减缓听功能的损伤。3.0mg/kg组的听功能损伤加重且PCR结果表达下降，考虑为该剂量对内毛细胞造成的损伤超过小鼠自我保护能力，顺铂可能从DNA、RNA、蛋白水平结合otoferlin，致使otoferlin蛋白合成减少。