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【目的】(1)为了探索过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)激动剂罗格利酮(rosiglitazone)对滋养细胞HTR8/SVneo、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和胎盘外植体中PPARγ表达和血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)表达和分泌的影响以及PPARγ在其中发挥的作用。(2)为进一步研究rosiglitazone诱导HTR8/SVneo、HUVECs细胞和胎盘外植体中ANGPTL4表达和分泌的分子调控机制。(3)研究正常妊娠孕妇和子痫前期患者胎盘组织中PPARγ和ANGPTL4表达以及血清中PPARγ循环激活剂的水平和ANGPTL4的分泌情况并统计分析二者之间的相关性。(4)研究ANGPTL4和PPARγ在滋养细胞HTR8/SVneo增殖和过氧化氢诱导的凋亡过程中的作用。(5)探索ANGPTL4和PPARγ在滋养细胞HTR8/SVneo迁移和侵袭以及胎盘外植体生长中的作用。(6)研究ANGPTL4和PPARγ在内皮细胞血管形成过程中的作用。【方法】(1)使用不同浓度的rosiglitazone处理HTR8/SVneo、HUVECs细胞和胎盘外植体,通过Western blotting、qRT-PCR、ELISA和免疫荧光检测其中PPARγ和ANGPTL4的mRNA和蛋白表达情况以及ANGPTL4的分泌;通过小干扰RNA沉默PPARγ的表达,进一步通过上述实验检测PPARγ在rosiglitazone诱导的ANGPTL4表达和分泌中的作用。(2)通过软件预测ANGPTL4启动子上潜在的PPARγ/RXRα结合位点,通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验在HTR8/SVneo、HUVECs细胞和胎盘外植体中确认具体的PPARγ/RXRα结合位点。(3)收集上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科诊治的30例正常妊娠孕妇和30例子痫前期患者的胎盘组织、血液和临床资料,通过免疫组化、Western blotting、qRT-PCR和ELISA检测胎盘组织中PPARγ和ANGPTL4的表达以及血清中PPARγ循环激活剂的水平和ANGPTL4的分泌情况并统计分析二者之间的相关性。(4)使用rosiglitazone处理转染si-Con或siANGPTL4的HTR8/SVneo细胞,通过TUNEL、CCK-8、Western blotting和qRTPCR实验检测rosiglitazone和ANGPTL4在HTR8/Svneo生存和增殖中作用以及与细胞增殖和凋亡相关基因的表达;此外,通过免疫组化检测两组孕妇胎盘组织中与凋亡相关蛋白caspase-3和增殖相关蛋白cyclin D1的表达情况。(5)使用rosiglitazone处理转染si-Con或者si-ANGPTL4的HTR8/SVneo细胞,通过划痕实验、transwell侵袭实验、胎盘绒毛外植体模型和Western blotting检测rosiglitazone和ANGPTL4在滋养细胞迁移、侵袭和胎盘绒毛外植体生长中的作用以及MMP2和MMP9的表达;与此同时,通过免疫组化检测两组孕妇胎盘组织中MMP2和MMP9的表达。(6)使用rosiglitazone处理转染si-Con或者siANGPTL4的HUVECs细胞,通过血管形成实验、Western blotting、qRT-PCR和ELISA检测rosiglitazone和ANGPTL4在内皮细胞HUVECs血管形成中的作用以及VEGF的表达和分泌情况;此外,通过免疫组化检测两组孕妇胎盘组织中PPARγ、ANGPTL4、CD31和VEGF的表达。【结果】(1)Rosiglitazone能够以浓度依赖的方式上调HUVECs细胞、HTR8/SVneo细胞和胎盘外植体中PPARγ和ANGPTL4的mRNA和蛋白水平的表达以及ANGPTL4的分泌;沉默PPARγ抑制rosiglitazone诱导的ANGPTL4的表达和分泌。(2)在ANGPTL4启动子区域存在3个潜在的PPARγ/RXRα结合位点,分别为:PPRE1(-1822/-1808),PPRE2(-809/-795)和PPRE3(-233/-209);ChIP实验结果证实:PPARγ/RXRα在ANGPTL4启动子的结合位点为PPRE3(-233/-209)。(3)相对于正常妊娠孕妇,子痫前期患者胎盘组织中PPARγ和ANGPTL4表达是显著减少;相似地,子痫前期患者血清中PPARγ循环激活剂的水平和ANGPTL4的分泌也是显著少于正常孕妇;统计分析还显示:两组孕妇胎盘组织中PPARγmRNA的表达与相应胎盘组织和血清中ANGPTL4的表达和分泌水平成正相关。(4)TUNEL实验、CCK-8实验、Western blotting和qRT-PCR研究结果显示:相对于对照组,rosiglitazone处理明显促进了HTR8/SVneo的增殖以及cyclin D1、c-Myc、Bcl-2和pHH3的表达;抑制了过氧化氢诱导的HTR8/SVneo的凋亡以及cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-3和caspase-9的表达;沉默ANGPTL4表达,rosiglitazone对HTR8/Svneo的这些作用将被阻断;对胎盘组织的免疫组化检测进一步证实:相对正常妊娠孕妇胎盘,PPARγ和ANGPTL4低表达的子痫前期患者胎盘中caspase-3表达是增加的,而Cyclin D1的表达是减少的。(5)细胞划痕实验、transwell侵袭实验和胎盘外植体实验结果表明:相对于对照组,rosiglitazone明显促进了HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭以及胎盘外植体的生长;Western blotting和明胶酶谱实验显示:相对于对照组,rosiglitazone明显促进了HTR8/SVneo中MMP2和MMP9的表达,抑制了TIMP-1和TIMP-2的表达;沉默ANGPTL4的表达,抑制了rosiglitazone的这些作用;除此之外,对胎盘组织的免疫组化检测也证实:相对正常妊娠孕妇的胎盘,PPARγ和ANGPTL4低表达的子痫前期患者胎盘中MMP2和MMP9表达也是减少的。(6)血管形成实验表明:相对于对照组,rosiglitazone明显促进了HUVECs细胞的血管形成;Western blotting、qRT-PCR和ELISA实验显示:相对于对照组,rosiglitazone显著促进了HUVECs中VEGF的表达和分泌;沉默ANGPTL4的表达,抑制了rosiglitazone的这些作用;更重要的是,进一步的胎盘组织的免疫组化检测表明:相对正常妊娠孕妇胎盘,PPARγ和ANGPTL4低表达的子痫前期患者胎盘中VEGF和CD31表达也是减少的。【结论】(1)Rosiglitazone通过PPARγ诱导ANGPTL4的表达和分泌。(2)ANGPTL4是PPARγ的一个靶基因,PPARγ/RXRα二聚体能够结合到ANGPTL4的启动子,促进其转录激活。(3)相对于正常妊娠孕妇,子痫前期患者胎盘组织中PPARγ和ANGPTL4的表达以及血清PPARγ循环激活剂的水平和ANGPTL4的分泌是减少的。(4)ANGPTL4介导rosiglitazone诱导的滋养细胞HTR8/SVneo的生存和增殖。(5)对于rosiglitazone诱导的HTR8/SVneo的迁移和侵袭以及胎盘外植体的生长,ANGPTL4是一个重要的介导者。(6)ANGPTL4参与rosiglitazone诱导的HUVECs细胞的血管形成。