银杏白果蛋白与内生菌蛋白的制备及特性的研究

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银杏是药食同源性植物,具有抗氧化、抑菌等作用,含有很多活性成分如蛋白、黄酮等,在医药和食品领域有着广泛的应用。但银杏资源的生长受气候、地域等影响,从而影响其开发与利用。植物内生菌能够产生与其宿主相同或相似的生理活性成分。本文从银杏中筛选具有高产蛋白能力的内生菌Pseudomonas R6,发酵制备菌体蛋白,与天然银杏白果蛋白进行功能和结构的对比研究,目的是用银杏内生菌生产出可以替代银杏白果蛋白的类银杏蛋白。论文研究结果如下:1.利用碱提酸沉法提取银杏白果蛋白,提取条件为:料液比1:30,碱提的pH为10,提取温度为50℃,水浴时间为2 h,此条件下的白果蛋白得率为10.6%;从实验室保存的9株内生菌中筛选出具有高产蛋白能力的菌株,其中银杏内生菌R6产蛋白量最高,选择R6为目标菌株,将其进行16S rRNA鉴定,最终鉴定菌株R6为假单胞菌属,命名为Pseudomonas R6。对Pseudomonas R6进行发酵制备菌体蛋白,产量为0.3 g/L。2.将两种蛋白纯化后均得到单一组分。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析,发现白果蛋白分子量主要以17 KDa为主,在2530 KDa有少量分布,菌体蛋白分子量则以48 KDa为主。通过红外光谱分析,发现两种蛋白图谱相似度非常高,略有偏移,均含有蛋白酰胺带的特征。测定两种蛋白氨基酸组成,发现两种蛋白氨基酸组成相似,均含有17种氨基酸,但是含量不同。白果蛋白中含有7种必需氨基酸,包括赖氨酸3.34%,苯丙氨酸9.14%,蛋氨酸0.14%,苏氨酸6.52%,异亮氨酸2.03%,亮氨酸0.41%,缬氨酸7.86%,氨基酸含量丰富,属于优质蛋白。菌体蛋白中也含有7种必需氨基酸,包括赖氨酸4.35%,苯丙氨酸9.91%,蛋氨酸0.16%,苏氨酸4.9%,异亮氨酸2.92%,亮氨酸0.3%,缬氨酸9.9%。微观构象对比:两种蛋白表面均有气孔存在,但白果蛋白呈现出结构紧密的大分子蛋白球并伴有微量的片状结构;而菌体蛋白整体呈现片状结构,伴有少量球形结构。3.白果蛋白和菌体蛋白的功能特性为:对白果蛋白和菌体蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性等性质进行研究,实验结果表明:在溶解性、持油性、起泡性和乳化性上,菌体蛋白优于白果蛋白;在持水性上,白果蛋白优于菌体蛋白。4.白果蛋白和菌体蛋白的体外抗氧化活性为:在样品浓度0.21 mg/mL时,白果蛋白的还原力高于菌体单白;对·OH清除作用,白果蛋白和菌体蛋白IC50分别为0.46mg/mL、1.54 mg/mL;对O2-·清除作用,白果蛋白和菌体蛋白IC50分别为3.16 mg/mL、4.18 mg/mL;对DPPH·清除作用,白果蛋白和菌体蛋白IC50分别为1.43 mg/mL、1.72mg/mL,其抗氧化能力和浓度呈正相关,白果蛋白的抗氧化活性高于菌体蛋白。通过对银杏白果蛋白和菌体蛋白结构和生物活性方面存在的相同点和不同点的研究,为未来银杏内生菌蛋白代替银杏白果蛋白进行产品开发和研究提供了理论依据,解决了银杏白果蛋白资源分布不均的问题,为银杏白果蛋白在工业化生产和实践中的广泛应用提供了新的方向。
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