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研究背景m TORC1是一种通过应对人体内外环境（比如氨基酸）的变化,而影响细胞生长和稳态的重要调节蛋白。m TORC1信号传导的失调,与许多人类的疾病相互关联,包括癌症,糖尿病和神经系统疾病等。当细胞内外的氨基酸含量发生变化时,氨基酸浓度变化所发出的信号可以通过Rag GTP酶传递到m TORC1,促使其发生溶酶体易位,进而通过小GTP酶Rheb的作用而激活。目前已经发现了许多种蛋白质复合物,在氨基酸浓度变化的刺激下,可以通过调节Rag GTP酶的活化状态,或者通过控制Rag GTP酶的溶酶体定位,来调节m TORC1的信号传导。比如FLCN-FNIP和GATOR1,已经分别被发现为Rag C/D和Rag A/B的GTP酶活化蛋白。其中,GATOR1蛋白复合体由DEPDC5、NPRL2和NPRL3三个亚基组成。在氨基酸饥饿的条件刺激下,GATOR1可以被KICSTOR复合物拴在溶酶体表面,进而通过功能亚基NPRL2,行使抑制m TORC1活性的作用。进一步的研究表明,GATOR2能够与GATOR1接触,起到拮抗GATOR1活性的作用,这也是m TORC1激活的重要条件。但GATOR2是如何介导GATOR1失活的,其详细机制尚不明确。最近的研究表明,多种m TORC1的活性调节蛋白,可以在氨基酸的刺激下,通过与GATOR2复合物相互作用来调节m TORC1信号传导。其中Sestrin2,SARB1和Castor1可以直接与胞质中的亮氨酸或精氨酸结合,通过GATOR2-GATOR1-Rag信号轴将亮氨酸和精氨酸结合到m TORC1上。与亮氨酸和精氨酸不同,蛋氨酸的调节则通过蛋氨酸循环代谢物SAM间接传导。在蛋氨酸缺乏的条件下,SAM的细胞内水平显着降低,当其低于SAMTOR和SAM的解离常数时与SAMTOR解离,进而促进了SAMTOR与GATOR1的相互作用,由此通过SAMTOR抑制m TORC1的激活。SAMTOR可以在不需要酶的参与下,自己结合和感知蛋氨酸并发挥作用。但是,GATOR1的GTP酶活化蛋白的活性是如何在蛋氨酸的刺激下被抑制的,其机制仍然不明。PRMT1属于1型PRMT酶,是蛋白质精氨酸甲基化酶家族的重要成员,能够催化包括组蛋白在内的40多种蛋白质底物的甲基化。其作为哺乳动物的主要精氨酸甲基转移酶,主要通过精氨酸单甲基化（MMA）和精氨酸不对称二甲基化（ADMA）发挥作用。PRMT1能够参与DNA损伤的修复、RNA代谢、细胞信号传导、蛋白质相互作用、转录调节的多种生理功能。其表达或胚胎发育的异常往往和肿瘤的发生发展密切相关。目前关于PRMT1和m TORC1之间的关系并不明确,鲜有报道。在我们的研究中,将探索PRMT1在m TORC1信号通路中发挥的作用及其机制。研究目的1、寻找GATOR1的调节因子,筛选与GATOR1复合物中功能亚基NPRL2相互作用的蛋白。2、验证PRMT1可以在氨基酸刺激下参与m TORC1激活,并进一步探寻其作用的分子机制。3、通过动物模型和临床标本,进一步验证PRMT1在m TORC1激活过程中的作用,并探寻其对肿瘤的影响。实验方法与结果1、我们通过免疫沉淀、质谱分析和GST-pulldown实验发现,PRMT1可以在细胞中与NPRL2相互作用。2、我们通过WB实验,发现在敲除PRMT1的细胞中,氨基酸诱导的m TORC1激活效应受到抑制。通过免疫荧光共聚焦实验,我们发现PRMT1的敲除也影响了蛋氨酸刺激下m TORC1的溶酶体易位。过表达Rag GTP酶的活性结构（Rag AQ66L/Rag C S75N）后,或敲除NPRL2,PRMT1的缺失都不再阻碍m TORC1的激活。3、我们通过免疫沉淀实验发现,蛋氨酸的刺激可以抑制SAMTOR与NPRL2的相互作用,并加强PRMT1和GATOR1之间的相互作用。过表达SAMTOR,可以以剂量依赖的方式破坏GATOR1和PRMT1之间的相互作用。敲除SAMTOR后,PRMT1与GATOR1的相互作用能力显著提高,并且不再依赖蛋氨酸的浓度刺激。敲除SAMTOR后,PRMT1的缺乏不再阻碍蛋氨酸介导的m TORC1激活。4、我们发现PRMT1的敲除,可以抑制蛋氨酸和SAM介导的m TORC1激活。我们通过WB和免疫荧光共聚焦实验,发现存在SAM结合能力缺陷的PRMT1突变形式（G98R和E162Q）,和敲除PRMT1的细胞一样,无法在蛋氨酸或SAM的刺激下激活m TORC1。我们使用抑制剂抑制了PRMT1甲基转移酶活性后,在GATOR1存在的条件下,蛋氨酸诱导的m TORC1的活性无法被激活。5、我们发现在蛋氨酸的刺激可以使溶酶体蛋白上总不对称二甲基化（ADMA）修饰的增加。通过溶酶体免疫沉淀实验,我们发现敲除NPRL2后,PRMT1不再定位于溶酶体上。而敲除SAMTOR,PRMT1仍然可以定位于溶酶体表面。6、我们通过免疫沉淀实验发现,蛋氨酸刺激可以以PRMT1依赖的方式调节GATOR1的亚基NPRL2的不对称二甲基化。抑制或敲除PRMT1,可以下调NPRL2的不对称二甲基化水平。同时将NPRL2的所有五个进化保守精氨酸残基突变为赖氨酸后,PRMT1无法再促使其发生不对称二甲基化。通过S6K磷酸化和m TORC1的溶酶体易位的检测,发现在NPRL2甲基化模拟突变体重组细胞中,蛋氨酸饥饿或抑制PRMT1都不能再抑制m TORC1的信号传导。7、我们从HEK293T细胞中纯化GATOR1复合物并进行体外甲基化测定,我们发现未甲基化的GATOR1复合物强烈地刺激了GTP水解,而PRMT1的甲基化则显著的抑制了这个水解过程。我们过表达并纯化野生型和甲基化模拟突变体,发现与野生型GATOR1复合物相比,甲基化的模拟突变体表现出了低得多的GAP活性。8、我们通过检测S6K的磷酸化水平,观察到禁食小鼠的m TORC1活性显著降低,而再喂养之后m TORC1活性加强。m TORC1抑制剂雷帕霉素（10mg/kg）或PRMT1抑制剂GSK3368715（100mg/kg）,都可以阻断再喂养后m TORC1活性加强的过程。在敲除肝细胞中的NPRL2后,再重复上述饥饿再喂养,以及GSK3368715抑制实验,可以观察到PRMT1抑制剂GSK3368715对m TORC1信号传导的抑制作用不再存在。因此,我们认为,PRMT1可以通过GATOR1复合物中的亚基NPRL2,调节肝脏中m TORC1的活化。9、我们通过代谢组学分析,发现PRMT1抑制剂GSK3368715可以阻断细胞生长所需的嘧啶和嘌呤前体代谢物的合成。我们通过蛋氨酸刺激下细胞活力的检测,发现相对于正常对照组,只敲除PRMT1时细胞活力明显下降,而同时敲除PRMT1和NPRL2时细胞活力和正常对照组没有明显差异。10、在动物实验中,我们将人乳腺癌细胞于裸鼠腹部皮下注射后形成肿瘤。我们观察到抑制PRMT1后,裸鼠的肿瘤明显小于正常对照组。我们通过对在临床中收集的乳腺癌骨转移肿瘤标本进行分析,通过组织切片磷酸化S6的免疫组织化学染色实验发现,在抑制PRMT1合成或抑制其酶活性的情况下,m TORC1的信号传导明显降低。研究结论我们的研究发现,PRMT1可以通过感知甲基供体SAM的细胞内浓度变化,激活m TORC1。在蛋氨酸的刺激下,SAM的细胞内浓度升高,使SAMTOR与GATOR1分离,通过GATOR1与PRMT1的相互作用,在多个精氨酸位点上使GATOR1复合体的亚基NPRL2发生甲基化,以抑制其GAP活性,最终激活m TORC1。我们还发现,抑制PRMT1的活性,可以以GATOR1依赖的方式,阻碍蛋氨酸介导的m TORC1的活化,进而抑制肿瘤的生长。因此,我们的研究可能可以为肿瘤的治疗提供新的靶点。