目的:暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure, FHF)是一种病死率极高的临床综合征,目前除肝移植外尚无特效的治疗措施,而肝源短缺、费用昂贵、术后长期应用免疫抑制剂限制了其在临床的实施,因此,寻找有效的临床内科治疗方法十分必要。然而发病机制的明确是创新科学、有效的治疗措施的基础。近年来,有关暴发性肝衰竭的研究取得了诸多进展,但是其具体机制尚不十分清楚。有学者提出炎症因子网络的激活在FHF的发生中起着重要作用,尤其是对位于炎症网络中心地位的核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的研究,成为最近十年的热点。研究发现,NF-κB可以通过启动转录多种炎症因子的表达促进炎症进展,如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthesis, iNOS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等。暴发性肝衰竭的病理研究认为除了肝细胞坏死,大量肝细胞凋亡参与了其病理过程。NF-κB能启动转录很多下游基因的表达,这些基因表达的产物不但参与了炎症反应的发生,而且在细胞凋亡中发挥着重要作用。NF-κB调控着一系列凋亡诱导和凋亡抑制基因的表达,包括凋亡蛋白酶(caspase)、死亡受体、凋亡抑制蛋白家族部分成员、Bcl-2蛋白家族部分成员以及某些原癌基因。但是由于刺激NF-κB活化的因素不同,活化的靶基因不同,NF-κB在调控细胞凋亡方面也发挥着不同的作用,通过信号转导途径既可抑制肝细胞的凋亡亦可促进肝细胞的凋亡。目前国内外对NF-κB在暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的作用研究较少。因此NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其机制尚不清楚。本研究采用Wistar大鼠腹腔注射D氨基半乳糖( D-galactosamine, D-GalN )后皮内注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)制造暴发性肝衰竭动物模型,并将应用NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)预处理的大鼠与模型组大鼠进行比较。通过采用常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、流式细胞学技术(flow cytometry, FCM)、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)判断比较抑制NF-κB表达前后肝组织细胞凋亡的情况,了解PDTC在暴发性肝衰竭中对NF-κB表达及肝细胞凋亡的影响,初步探讨NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用。应用免疫组化及反转录多聚酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)方法,从蛋白、基因水平检测c-myc、survivin表达,探讨NF-κB是否通过调节凋亡相关基因c-myc、survivin的表达参与暴发性肝衰竭的发病。为临床如何应用NF-κB抑制剂治疗肝衰竭提供理论依据。方法:1研究对象:雄性Wistar大鼠60只,清洁级,体重180-200g。大鼠禁食24小时后,随机分为2组,即模型组和PDTC组,每组30只。模型组应用D-GalN800mg/kg+LPS10ug/kg制造暴发性肝衰竭模型;PDTC组应用PDTC100mg/kg预处理,余同模型组。2标本采集和保存:从PDTC组、模型组各取6只分别于给D-GalN +LPS后2、4、8、12、24小时行股静脉放血处死,迅速小心剖出肝脏,取适量肝组织分别固定于10%中性甲醛液、70%乙醇中,部分肝组织液氮冰冻后存放于-80℃冰箱;将全血放置30min,离心取上层血清行生化学检测。3 HE染色光镜下观察肝组织病理学变化。4采用Olympus AU2700全自动生化分析仪对两组大鼠血清进行肝功能检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)及总胆红素(total bilirubin, TB)。5采用免疫组织化学S-P法对肝组织标本进行NF-κB p65、c-Myc、survivin蛋白染色。6采用RT-PCR方法对NF-κB、c-myc、survivin mRNA进行半定量分析。7应用流式细胞学技术测定70%乙醇固定的两组肝组织细胞凋亡率(apoptotic rate, AR),进行分析比较。8 TUNEL法检测两组肝组织原位肝细胞凋亡情况,凋亡指数(apoptotic index, AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。9统计学处理:应用spss11.5统计软件进行统计学分析,采用秩和检验和Spearman秩相关分析对数据进行统计。结果:1一般状况观察:模型组大鼠随着给药时间的延长出现活动减少、反应迟钝、毛发竖立、嗜睡、昏迷等情况;PDTC组大鼠一般状况好于模型组,给药后24小时只有毛发竖立、活动少等表现,无嗜睡、昏迷等肝性脑病表现。2肝组织形态学观察:(1)大体标本观察:模型组大鼠肝脏随着给药时间的延长出血点及淤血斑均逐渐增多,到24小时肝组织呈暗红色,大片出血,淤血严重;PDTC组随着给药时间的延长,只有出血点增多,至24小时仍未见大片出血、淤血现象。(2)HE染色:模型组大鼠肝组织病理显示给药后2小时肝小叶完整,肝索排列规则;4小时可见肝细胞嗜酸性变及凋亡小体,少量炎细胞浸润;8小时可见灶状坏死,伴炎细胞浸润,可见多量凋亡小体;12小时肝细胞片状坏死,可见炎细胞浸润,可见凋亡肝细胞;24小时肝组织大片坏死,出血严重,残留散在肝细胞及凋亡小体;PDTC组大鼠肝细胞坏死、凋亡较模型组均明显减轻。3生化检测结果:模型组大鼠血清ALT及TB水平随着给药时间的延长呈现上升趋势,12、24小时急剧升高;PDTC组大鼠血清ALT、TB较模型组降低,各时间点两组之间p值分别为(ALT: 0.025、0.037、0.631、0.004、0.004;TB: 0.747、0.045、0.872、0.004、0.004)。4细胞凋亡的变化:流式细胞学技术检测细胞凋亡率及TUNEL法计算凋亡指数结果均显示模型组呈现上升趋势(p<0.05);PDTC组较模型组细胞凋亡减少(p<0.05)。5 NF-κB的表达变化:模型组大鼠肝组织随着给药时间的延长,在基因及蛋白水平表达均呈现上升趋势(p<0.05);PDTC组较模型组下降(p<0.05)。6 c-myc、survivin表达变化:模型组肝组织c-myc、survivin mRNA表达在4、24呈现双峰,PDTC组肝组织survivin mRNA表达较模型组无明显下降(p>0.05),c-myc mRNA在4、8、24小时较模型组表达下降(p<0.05),2、24小时无明显下降(p>0.05);模型组肝组织c-Myc蛋白表达在4、24小时呈现双峰,Survivin呈现上升趋势,PDTC组肝组织表达较模型组无明显下降(p>0.05)。7 Survivin、c-myc表达与细胞凋亡率相关性分析:survivin、c-myc表达与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.491、-0.414,p=0.000、0.004)。结论:1利用D-GalN联合LPS制造暴发性肝衰竭大鼠模型,从形态学、细胞学以及基因水平证实了肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭病理过程中起着重要作用。2从细胞、蛋白和基因水平证实NF-κΒ在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭发病中除了促炎作用,还能诱导肝细胞凋亡。3从蛋白和基因水平证实了在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭中抗氧化剂PDTC能有效抑制NF-κΒ的表达。4 PDTC能通过抑制NF-κΒ活性,减轻D-GalN+LPS所致暴发性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡,改善病情,为临床应用NF-κB抑制剂治疗肝衰竭提供了理论依据。5 c-Myc、survivin在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭中具有抑制肝细胞凋亡的作用,但NF-κΒ对其无明确的调控作用,提示NF-κΒ调控肝细胞凋亡的机制复杂,尚需进一步研究。