炎症是免疫反应的重要组成部分,是机体针对病原体、组织损伤等刺激产生的重要病理生理反应,其目的是清除感染源、恢复组织稳态。为了既能达到良好清除效果又能避免对宿主的过度损伤,炎症反应的进程受到严格的调控。在炎症反应的初始阶段,组织原位的巨噬细胞侦测到损伤信号后被激活,并迅速在损伤部位募集中性粒细胞;继而大量单核细胞浸润,并在致炎微环境作用下分化成巨噬细胞。一经激活,这些巨噬细胞呈现促炎的经典激活表型（M1型）,分泌大量促炎细胞因子。随着炎症的发展,中性粒细胞吞噬病原体或坏死组织后发生凋亡,而巨噬细胞清除摄入死亡中性粒细胞后表型向抗炎、促修复的选择激活型（M2型）转化,进而形成有利于炎症消退的微环境,实现炎症部位细胞组织的稳态重建。炎症的消退,涉及到免疫细胞与微环境的复杂相互作用,其关键环节的失调常导致炎症消退障碍,是多种慢性炎症性伤病的重要原因。因此,深入研究炎症消退的细胞、分子机制,并探索新的调节策略,对于诸如慢性难愈创面、炎症性肠病等炎症消退障碍疾病的防治具有重要意义。丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK7（Serine Peptidase Inhibitor,Kazal Type 7）,又名ECRG2（Esophagus Cancer-Related Gene 2,食管癌相关基因2）,定位于人5号染色体（小鼠为18号染色体）,编码区域有258个碱基,翻译成含85个氨基酸的9.23k D大小的蛋白产物,可以分泌到胞外,在食管上皮、口腔粘膜等组织呈组成性高表达。最初通过基因差异表达筛选发现在食管癌组织表达显著降低。早期的研究发现,SPINK7可以通过胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂活性和胞内非丝氨酸蛋白酶抑制剂活性两种途径发挥作用,调控细胞的增殖、凋亡、迁移与侵袭等重要表型,发挥抑癌基因的功能。最新的研究表明,SPINK7作为抑制性检查点分子调控食管上皮炎症反应,参与嗜酸性食管炎（Eosinophilic Esophagitis,Eo E）的发生发展。研究显示,相对于正常食管上皮,SPINK7在Eo E病人的食管组织表达显著降低达15倍之多;在正常食管上皮细胞敲降/敲除SPINK7可抑制上皮分化进而削弱其屏障功能,更重要的是其可通过抑制u PA/u PAR促进嗜酸性粒细胞的活化,靶向下调KLK5（Kallikrein 5）蛋白酶活性,抑制PAR-2（Rroteinase-activated receptor 2,PAR2）活化调控诸多趋化因子/细胞因子的表达,发挥炎症反应抑制性检查点的功能。但目前关于SPINK7作为抑制性检查点分子调控炎症反应的研究仅限于食管上皮,其作用是否有普遍意义,即在其他系统中炎症反应调节的功能,有待进一步深入研究。本研究分别在小鼠皮肤创伤愈合模型和实验性结肠炎模型对SPINK7调控炎症消退的作用进行了系统研究并初步探讨了其作用机制。在小鼠急性创面愈合实验中,利用组织学染色技术、免疫组化染色技术、q RT-PCR、组织RNA芯片、多重荧光酶联免疫检测、明胶酶活性检测、尿激酶活性检测等技术分析了Spink7缺失对创面愈合速率、再上皮化水平、炎性细胞浸润、促炎/趋化因子分泌水平、蛋白酶活性水平、巨噬细胞极化比例的影响,明确Spink7对创面愈合炎症反应消退的影响和作用;以PAR2抑制剂进行在体干预,评价抑制该通路对Spink7缺失导致的炎症消退障碍、愈合延迟等表型的影响;利用Raw264.7细胞,通过慢病毒稳定转染、细胞条件上清刺激培养、纯化蛋白刺激培养等方法提高Spink7水平观察对于LPS诱导的炎症反应的影响,对Spink7的抗炎机制进行初步探讨;并在由于炎症反应不足导致愈合延迟的放创复合伤小鼠模型,评价了创面原位si RNA敲降Spink7促进创面愈合的可行性。本部分所取得的主要实验结果和结论如下:1.小鼠皮肤创伤修复过程中Spink7在增殖期创面表达显著上调,创面局部采用Spink7特异性si RNAs抑制其表达,导致以再上皮化延迟、炎症消退障碍为特征的延迟愈合表型。2.以Spink7敲除小鼠为对象,发现Spink7敲除与si RNAs的敲降表现出类似的炎症消退障碍表型。进一步研究发现,Spink7敲除导致增殖期创面（伤后7 d）存在:炎症相关通路过度激活,促炎细胞因子IL-6,IL-1β和TNF-a和趋化因子KC、MIP-2和MIP-1a的分泌增多;u PA、MMP2/9等蛋白酶存在过度活化;巨噬细胞M2极化显著不足。3.以PAR2抑制剂进行在体干预,发现Spink7敲除导致的难愈表型不依赖于PAR2通路的激活。4.体外细胞实验表明,采用慢病毒稳定感染、条件上清作用、纯化蛋白刺激等上调巨噬细胞培养体系中Spink7蛋白水平的方法,均能够抑制LPS刺激导致的促炎细胞因子等基因的表达上调,并初步发现Spink7可以负调控LPS诱导的NF-κB和p38MAPK信号通路的激活。5.在小鼠放创复合伤的创面延迟愈合模型中,Spink7的表达水平较单纯急性创面显著上调,局部采用Spink7特异性si RNAs抑制其表达,可以调高放创复合伤创面炎症反应,促进其愈合。在小鼠实验性结肠炎模型,利用2%DSS诱导造模,通过组织学染色技术、免疫组化染色技术、q RT-PCR、Bio-Plex多重蛋白检测技术、激光共聚焦显微观察、骨髓移植嵌合体小鼠构建、生物信息学分析技术检测Spink7缺失对小鼠实验性结肠炎的溃疡症状的影响,初步明确该分子对实验性结肠炎炎症表型的调控作用。本部分所取得的主要研究结果和结论如下:1.Spink7在DSS诱导的实验性结肠炎模型中呈诱导性高表达。Spink7敲除小鼠对结肠炎损伤敏感性显著增高,表现为体重下降明显、结肠炎临床症状更严重、结肠长度更短、组织病理学评分更严重等;相应的一系列促炎细胞因子和趋化因子的表达、分泌较野生对照小鼠也显著增高。2.通过构建骨髓移植嵌合体小鼠,证明骨髓造血细胞来源的Spink7对实验性结肠炎发挥了主要保护作用。进一步通过多重免疫荧光标记实验,表明Spink7主要在实验性结肠炎组织的中性粒细胞中表达。3.通过免疫组化染色和公开数据库分析等方法,评估SPINK7在人炎症性肠病组织中的表达模式。发现SPINK7在人结肠组织上皮呈组成性表达,在人炎症性肠病存在表达下调的趋势。综上所述,本研究采用小鼠皮肤创面愈合模型和实验性结肠炎模型进行研究,结果表明Spink7作为炎症反应的抑制性检查点分子,是促进炎症消退的关键因子。在皮肤创面愈合模型,研究发现Spink7缺失导致炎症消退障碍为特征的难愈表型,初步的机制探讨排除其依赖PAR2激活导致该表型,体外细胞实验显示Spink7可通过抑制NF-κB等通路拮抗LPS诱导的巨噬细胞M1极化表型,而在放创复合伤创面干预敲降Spink7则可通过调高炎症反应促进创面愈合。在实验性结肠炎模型,研究表明Spink7缺失导致肠炎损伤程度加重,而中性粒细胞来源的Spink7发挥了主要的抗炎保护作用。这些结果丰富了对于炎症消退调控的细胞分子机制的理论认识,为探索对于诸如慢性难愈创面、炎症性肠病等炎症消退障碍疾病的防治策略提供了新靶点。