荧光成像技术具有对动物无害、非侵入、高灵敏和可进行活体多目标成像等优点。对荧光标记靶点进行三维定位，能够提供发光信号的三维空间位置信息，对于实际的生物及医学应用有很重大的意义。本文参与设计并搭建了一种近红外荧光活体成像系统，并以此为实验平台，选用近红外量子点作为荧光标记靶点，进行了靶点的三维定位方法的研究。文中根据靶点定位的实际需要，对常用的图像预处理方法进行了比较和选取，提出了一种用于提取靶点信号的多光谱分离方法，以及分离后的靶点光斑中心的提取方法。在针孔摄像机模型以及摄像机的畸变模型的基础上讨论了摄像机的标定方法，并基于对双目立体视觉模型的分析，讨论了双摄像机位置的立体标定和立体校正，综合以上提出了靶点三维坐标的计算方法。并设计了模拟实验，对该方法的有效性进行了验证，通过对实验数据的分析和讨论，证明了该方法可用于小动物浅表层的荧光靶点三维定位。