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系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及多器官多系统的典型的自身免疫性疾病。近年的研究表明,髓源抑制性细胞(MDSCs)是一群异质性的未成熟髓系细胞。目前发现,在肿瘤、肥胖和慢性炎症等病理条件下MDSCs具有抑制T细胞的功能。然而,我们及一些研究表明,在SLE病程中MDSCs大量累积,且与疾病进展相关,可是,MDSCs如何参与SLE疾病发生的机制尚不清楚。Toll样受体(TLRs)是一类主要表达于固有免疫细胞的病原模式识别受体。普遍认为,狼疮患者和小鼠模型中TLRs异常高表达和活化,特别是Toll样受体7(TLR7)高度活化与SLE进展密切相关。还有研究报道,C型凝集素样受体(CLRs)可能参与自身免疫性疾病的发生,其信号的活化能诱导髓系前体细胞扩增,且TLRs与CLRs可协同启动Th细胞分化/极化参与炎症性疾病的发生。CLRs包括树突状细胞相关性C型凝集素样受体(Dectin)-1、Dectin-2、Dectin-3和Mincle,且这些受体主要表达于髓系细胞。有趣的是,我们预实验发现TLR7激动剂R848能促进MDSCs中Dectin-3的表达,而且Dectin3基因敲除(Dectin-3~(-/-))小鼠的狼疮症状显著轻于野生型(WT)狼疮小鼠。可见,在SLE发生过程中,MDSCs的异常可能不仅受TLR7信号的调控,而且也受Dectin3途径的调控。可是,TLR7与Dectin3如何调控MDSCs进而影响SLE的机制迄今尚未报道。因此,本课题主要以狼疮小鼠模型为研究对象,分析了TLR7信号与MDSCs数量和功能以及Dectin3表达的关系;揭示了TLR7与Dectin3交互调控MDSCs数量及功能的机制。本研究的具体实验方法及结果如下:1.TLR7通过调控Dectin3信号影响狼疮发展及MDSCs数量和功能:为了探究TLR7信号与Dectin3信号是否对狼疮发病有协同作用,我们利用野生型(WT)和Dectin3基因敲除鼠(Dectin3~(-/-))构建了2种狼疮小鼠模型,即pristane诱导和TLR7激动剂-咪喹莫特诱导的小鼠模型。检测狼疮发病过程中不同周龄WT和Dectin3~(-/-)小鼠狼疮的症状和相关组织中的免疫细胞变化。结果表明,在pristane诱导的狼疮模型中,Dectin3~(-/-)小鼠的狼疮症状从第3个月开始低于WT狼疮小鼠。流式细胞术检测结果显示,与WT狼疮小鼠相比,Dectin3~(-/-)狼疮小鼠外周血单个核细胞、骨髓、肾脏和脾脏组织中的MDSCs、Th17细胞、活化的B细胞和T细胞比例明显降低,但是Treg细胞显著增加。Dectin3~(-/-)狼疮小鼠的MDSCs免疫抑制能力相较于WT狼疮小鼠更强。相似的结果也在TLR7激动剂-咪喹莫特诱导的小鼠模型中获得。为了探究Dectin3是否通过调控MDSCs的数量和功能参与狼疮发生,我们向TLR7激动剂-咪喹莫特诱导的WT狼疮小鼠过继转移Dectin3~(-/-)狼疮小鼠的MDSCs,结果表明,与未移植MDSCs的WT狼疮小鼠相比,移植MDSCs的WT狼疮小鼠的症状得到明显缓解。这些结果提示,TLR7可通过Dectin3信号影响狼疮进展,且Dectin3可通过促进MDSCs扩增及功能异常参与狼疮发生。但Dectin3是如何调控狼疮的MDSCs数量和功能尚不明确。2.Dectin3通过Syk-Akt1-FoxO1信号轴调控MDSCs凋亡及免疫功能:为了探究Dectin3调控MDSCs扩增及功能异常的分子机制,我们利用TLR7激动剂-咪喹莫特诱导的狼疮模型小鼠,然后从WT和Dectin3~(-/-)狼疮小鼠的脾脏中分选纯化MDSCs,并进行全转录组基因芯片分析。生物信息学分析发现MDSCs的凋亡信号位于前10,提示Dectin3~(-/-)的狼疮小鼠中MDSCs数量的减少可能与凋亡相关。于是,我们分析了与细胞凋亡相关的指标,结果表明,与WT狼疮小鼠相比,Dectin3~(-/-)狼疮小鼠脾脏MDSCs的凋亡比例增加,促凋亡相关蛋白Bim和Bax表达也增加,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低。通过全信号转导网络分析,发现FoxO1基因处于网络重要位置,且与WT狼疮小鼠MDSCs相比,Dectin3~(-/-)的MDSCs中FoxO1基因显著高表达,表明FoxO1在调控MDSCs增殖和凋亡过程中发挥重要作用。我们通过基因共表达分析发现,FoxO1与Akt1具有靶向关系。已知Syk可以调控Akt1的转录表达,而Dectin3可以通过激活Syk启动下游的固有免疫应答。我们通过对WT和Dectin3~(-/-)狼疮小鼠脾脏中MDSCs分析及对体外骨髓诱导的MDSCs进行一系列的干扰和过表达实验分析,结果表明,Dectin3可通过Syk-Akt1-FoxO1信号轴抑制MDSCs的凋亡,降低MDSCs免疫抑制能力及促进其炎性因子的产生。MDSCs是一群高度异质性的细胞群,且具不同亚群。因此,探讨狼疮中Dectin3通过FoxO1调控哪群MDSCs至关重要。3.Dectin3通过FoxO1促进LOX-1~ M-MDSC累积加剧狼疮进程:为了分析Dectin3~(-/-)狼疮小鼠中发挥重要作用的MDSCs亚群,我们检测WT和Dectin3~(-/-)狼疮小鼠脾脏、骨髓和肾脏组织中G-MDSC和M-MDSC数量变化,结果显示,与WT狼疮小鼠相比,Dectin3~(-/-)狼疮小鼠组织中M-MDSC的数量显著下调。为了深入探究Dectin3如何调控M-MDSCs参与狼疮发生,我们将WT和Dectin3~(-/-)狼疮小鼠脾脏中的M-MDSCs分选纯化并进行全转录组基因芯片分析发现,与WT狼疮小鼠M-MDSCs相比,Dectin3~(-/-)的M-MDSCs表面标志相关基因LOX-1表达显著降低。我们进一步用流式细胞术检测WT和Dectin3-/-狼疮小鼠相关组织M-MDSCs中LOX-1的表达进行分析;结果表明,与WT狼疮小鼠相比,Dectin3~(-/-)小鼠LOX-1~ M-MDSCs的数量显著降低且炎性因子的产生下降。为了进一步揭示Dectin3是否通过FoxO1对M-MDSCs中LOX-1表达进行调控,我们对WT和Dectin3~(-/-)小鼠骨髓诱导的M-MDSCs进行敲低和过表达FoxO1实验并对实验结果进行分析。我们发现增加M-MDSCs中FoxO1表达可以显著降低LOX-1的蛋白产生;此外,与LOX-1高表达的M-MDSCs相比,低表达LOX-1的M-MDSCs对T细胞的免疫抑制能力显著增强,且促炎能力下降。我们进一步对WT和Dectin3~(-/-)的狼疮小鼠进行体内注射FoxO1小干扰片段或重组FoxO1腺病毒处理。结果表明,与未干扰FoxO1的Dectin3~(-/-)狼疮小鼠相比,干扰FoxO1表达的Dectin3~(-/-)狼疮小鼠体内MDSCs的凋亡水平受到抑制,并促进LOX-1~ M-MDSCs的扩增且加剧狼疮小鼠的症状。为了确认Dectin3通过促进FoxO1调控LOX-1~ M-MDSCs累积参与狼疮发生,我们分别获取了10例SLE非活动期病人和10例SLE活动期病人的外周血,并对SLE非活动期和活动期患者外周血MDSCs进行流式细胞术分析。结果显示,与SLE非活动期患者相比,SLE活动期患者外周血MDSCs的Dectin3的表达水平显著增加,而FoxO1的表达显著降低。特别是,与SLE非活动期患者相比,SLE活动期患者外周血中LOX-1~ M-MDSCs的比例不仅显著增加,而且与狼疮的发病指数密切相关。综上所述,本研究:(1)首次发现Dectin3通过调控MDSCs数量和功能参与狼疮发展与TLR7的关系。(2)揭示Dectin3可通过Syk-Akt1-FoxO1信号轴调控MDSCs凋亡及免疫功能。(3)发现Dectin3通过FoxO1促进累积的LOX-1~ M-MDSC可能是狼疮进程加剧的潜在靶细胞。本研究结果为解释狼疮的发病机制提出了新视点,也为狼疮治疗提供新的靶点。