背景:原发性肝癌是一种严重威胁全人类生命健康的疾病,而肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占所有原发性肝癌总数的比例高达90%,根据2015年世界肝癌流行病学统计,HCC在全球癌症中发病率位居第五,致死率位居第三,是一个主要的国际健康问题。自Warburg效应提出之后,葡萄糖一直是癌症代谢研究的核心,随之而来,对谷氨酰胺(Glutamine,Gln)等其他营养物质的研究也逐步成为肿瘤代谢研究的热点。谷氨酰胺是血清中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生物学作用,比如可用于核苷酸、其他氨基酸和蛋白质合成、支持重要的抗氧化剂之一:谷胱甘肽(Glutathione,GSH)合成、其分解代谢产生的α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)也可以为三羧酸循环补充中间代谢物。因此,谷氨酰胺是肿瘤的条件必须氨基酸,谷氨酰胺成瘾也一直被认为是大多数肿瘤代谢特征之一。靶向谷氨酰胺代谢,研发其抑制剂作为抗肿瘤药物,为肿瘤治疗提供新的新方向。然而,临床实验证明这些抑制剂并不是对所有肿瘤有效,且单独使用这些抑制剂的治疗潜力有限。因此,阐明肿瘤细胞如何调控自身谷氨酰胺代谢抵抗谷氨酰戒断的治疗手段,并维持自身生存的机制,将为靶向谷氨酰胺代谢的抗肿瘤治疗提供新的治疗策略,具有重要的科学意义和潜在的临床价值。材料和方法:本研究首先对TCGA数据库中HCC/癌旁组织m RNA测序数据进行分析,确定肝癌组织中谷氨酰胺代谢关键酶的表达差异,并用q RT-PCR对这些关键酶在肝癌细胞与正常肝细胞的表达进行验证。然后分析了这些关键酶对临床患者的生存期的影响。其次,以肝癌细胞系作为实验模型,分别以谷氨酰胺剥夺及补充α-KG或铁死亡抑制剂Fer-1作为实验组,检测上述分组肝癌细胞数量,活力和死亡情况;利用试剂盒检测活性氧(active oxygen species,ROS)、GSH、谷氨酸(glutamate,Glu)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)随时间的变化;用酶活测定试剂盒测定GSH合成,使用途径关键酶的酶活性。最后,通过western blot和q RT-PCR检测了的GOT1、c-Myc和Keap1-Nrf2信号通路与其下游GCLM和GPX4的表达。之后预测c-Myc与GOT1的表达相关性以及其潜在结合位点,并利用si RNA干扰c-Myc检测相关蛋白表达以验证c-Myc是其上游分子。利用染色质免疫共沉淀实验验证c-Myc和GOT1启动区的直接结合。利用si RNA干扰c-Myc或GOT1后检测了肝癌细胞的存活及氧化还原相关小分子含量。此外,我们构建谷氨酰胺剥夺的裸鼠移植瘤模型验证了c-Myc和GOT1在谷氨酰胺剥夺后对移植瘤生存及其GSH合成的影响。结果:研究发现GCL、GSS、GPX4和GSR在肝癌组织中表达上调,GOT1、GPT1和Gl UD1在肝癌组织表达下调,q RT-PCR实验结果验证了这些酶肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721与正常肝细胞LO2中的表达差异。谷氨酰胺剥夺初期,肝癌细胞数量以及GSH含量减少,但是随着时间的增加,肝癌细胞的数量得到一定恢复并且GSH同样维持在正常水平,谷氨酰胺剥夺后补充α-KG能一定程度促进GSH合成和肝癌细胞生存,Fer-1无助于GSH合成但可抑制肝癌细胞死亡。谷氨酰胺剥夺后,GSH含量减少致使脂质过氧化水平升高,升高的ROS激活了Keap1-Nrf2-ARE信号通路,进而上调其下游的GCL以及GPX4的表达。此外,谷氨酰胺剥夺后上诱导了GOT1及c-Myc的m RNA和蛋白表达。GOT1及c-Myc在肝癌的表达具有相关性,GOT1启动区具备c-Myc潜在结合位点,并且Ch IP实验表明c-Myc直接结合于GOT1的启动区促进其表达。另外,肝癌细胞中其他GSH合成底物氨基酸转运体的m RNA表达在谷氨酰胺剥夺后上调。当GOT1被沉默,谷氨酰胺剥夺条件下的肝癌细胞生存及裸鼠移植瘤被明显抑制,且GSH含量维持在低水平,而ROS和MDA含量升高。当c-Myc被沉默,肝癌细胞及裸鼠移植瘤的GOT1、Nrf2、GCLM和GPX4表达被抑制。结论:1.谷氨酰胺在肝癌中分解代谢产生的Glu主要用于合成GSH以增强其抗氧化能力,而非进入TCA循环或者合成其他氨基酸。2.谷氨酰胺剥夺后,肝癌细胞GOT1和Nrf2表达上调,GOT1及Nrf2的下游分子共同完成了α-KG—Glu—GSH的合成途径,降低了ROS水平,进而抑制了铁死亡。3.谷氨酰胺剥夺激活c-Myc表达,c-Myc直接结合GOT1启动区促进其转录。沉默GOT1联合谷氨酰胺戒断可以更好达到抑制肝癌的效果。