线粒体对众多的细胞进程至关重要,包括能量代谢、细胞程序性死亡、氨基酸生物合成、蛋白质质量控制和降解等。大多数的线粒体蛋白需要在胞质中合成,然后通过特异性蛋白转位酶转运到特定的线粒体亚结构区域。蛋白转位酶复合物包括:线粒体外膜转位酶(TOM复合物)、线粒体外膜分选和装配机器(SAM复合物)、线粒体转运复合物(MIA复合物)、线粒体膜间隙转运与装配机器(MIA复合物)、线粒体内膜载体蛋白转位酶(TIM22复合物)和线粒体内膜前导序列转位酶(TIM23复合物)。TIM22复合物负责疏水性膜蛋白的转运和插膜,包括线粒体载体蛋白和转位酶亚基(Tim17、Tim22和Tim23)。人源TIM22复合物包含至少6个组分:Tim22(假设的通道形成蛋白)、Tim29、Tim9、Tim10a、Tim10b和AGK。尽管在TIM22复合物的功能和疾病发生研究中取得了很大进展,但是TIM22复合物的结构特征和载体蛋白的转运机制依然不清楚。本研究围绕人源线粒体转位酶TIM22复合物的结构与功能展开,取得以下3个方面的进展:1、体外重组共表达获得性质均一的人源线粒体转位酶TIM22复合物在本课题研究中,我们利用p MLink体外重组共表达系统,将TIM22复合物6个亚基在Expi293F细胞系中共表达。通过Flag标签亲和纯化和分子筛层析纯化,我们获得性质均一的TIM22复合物。质谱分析证实纯化TIM22复合物含有已知的6种组分。2、通过单颗粒冷冻电镜技术解析了人源线粒体转位酶TIM22复合物结构通过去垢剂筛选、p H缓冲体系筛选、冷冻电镜制样条件筛选,我们获得了可用于300 k V冷冻电镜数据收集的样品。我们共收集14105张照片,从中自动挑选2401464个单颗粒进行后续2维分类、3维分类,以及最后的3维重构和模型搭建与优化。最后解析了人源TIM22复合物结构,整体分辨率为3.73埃,复合物膜间隙区域分辨率为3.53埃。3、人源线粒体转位酶TIM22复合物结构分析和生化验证在人源TIM22复合物结构中,含有1分子Tim22、1分子Tim29、1分子AGK、2个分子伴侣六聚体复合物Tim9-Tim10a(3:3)和Tim9-Tim10a-Tim10b(2:3:1)。核心亚基Tim22包含4个跨膜螺旋,这些跨膜螺旋形成1个开口朝向脂双层的腔。我们推测Tim22的功能可能类似于Yid C插入酶家族。Tim29是1个单次跨膜蛋白,通过其N端螺旋来稳定Tim22蛋白;同时通过其C端膜间隙结构域与AGK和2个分子伴侣六聚体复合物相互作用来维持TIM22复合物的完整性。BN-PAGE分析和体外蛋白转运生化分析结果显示分离的TIM22复合物是一种有功能的形式。突变分析结果证实解析的人源TIM22复合物结构的正确性。这一系列研究成果揭示了TIM22复合物的装配和详细的结构信息,为我们理解TIM22复合物转运载体蛋白的分子机制提供结构基础。同时也为线粒体转运系统相关疾病提供潜在的药物靶点。