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研究背景与目的肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)约占肺癌的80%-85%,肿瘤转移是肺癌患者死亡的最主要原因。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)是上皮来源的肿瘤细胞发生侵袭和转移的前提条件。DAL-1(Differentially expressed in Adenocarcinoma of the Lung)是抑癌基因,可抑制肺癌细胞EMT的发生,HSPA5(Heat Shock Protein 5)是癌基因,可促进肺癌细胞EMT的发生,HSPA5蛋白可以和DAL-1蛋白直接结合。二者在EMT发生中的作用究竟如何?目前尚无相关研究报道。本实验研究DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌中的表达关系,并探讨它们与EMT发生的关系。研究方法一、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中的表达关系1、利用Western blot方法检测不同非小细胞肺癌细胞中DAL-1和HSPA5的蛋白表达水平。2、利用免疫荧光和激光共聚焦扫描技术观察DAL-1蛋白和HSPA5蛋白在H460细胞中的共定位情况。3、分别用过表达DAL-1的慢病毒(LV-DAL-1)和阴性对照病毒(LV-CON1)感染A549细胞,利用RTq-PCR和Western blot方法检测过表达DAL-1对HSPA5的mRNA和蛋白表达的影响。4、分别用过表达HSPA5的慢病毒(LV-HSPA5)和阴性对照病毒(LV-CON2)感染A549/LV-DAL-1细胞,利用RTq-PCR和Western blot方法检测过表达HSPA5对DAL-1的mRNA和蛋白表达的影响。二、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响1、实验分为两组:A549/LV-DAL-1(实验组)和A549/LV-CON1(阴性对照组)。利用RTq-PCR和Western blot方法检测E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达水平;利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;利用细胞划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验检测细胞体外侵袭和迁移能力。2、分别用干扰HSPA5表达的慢病毒(LV-HSPA5 RNAi)和阴性对照病毒(LV-CON3)感染A549细胞,分别命名为A549/LV-HSPA5 RNAi(实验组1)和A549/LV-CON3(阴性对照组1)。分别用过表达HSPA5的慢病毒(LV-HSPA5)和阴性对照病毒(LV-CON2)感染A549/LV-HSPA5 RNAi细胞,分别命名为A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-HSPA5(实验组2)和A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-CON2(阴性对照组2),利用上述方法检测HSPA5对A549细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响。三、DAL-1是否通过HSPA5影响EMT、增殖、侵袭和迁移的研究1、分别用过表达HSPA5的慢病毒(LV-HSPA5)和阴性对照病毒(LV-CON2)感染A549/LV-DAL-1细胞,分别命名为:A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5(实验组1)和A549/LV-DAL-1/LV-CON2(阴性对照组1);分别用干扰HSPA5表达的慢病毒(LV-HSPA5 RNAi3)和阴性对照病毒(LV-CON3)感染A549/LV-DAL-1细胞,分别命名为A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5 RNAi(实验组2)和A549/LV-DAL-1/LV-CON3(阴性对照组2)。利用上述方法检测HSPA5对A549/LV-DAL-1细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响。四、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路的影响1、实验分为两组:A549/LV-DAL-1(实验组)和A549/LV-CON1(阴性对照组)。利用Western blot方法检测两组细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。2、实验分为四组:A549/LV-HSPA5 RNAi(实验组1)、A549/LV-CON3(对照组1)、A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-HSPA5(实验组2)和A549/LV-HSPA5RNAi/LV-CON2(对照组3),利用Western blot方法检测各组细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。五、DAL-1是否通过HSPA5影响PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路的研究实验分为两组:A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5(实验组)和A549/LV-DAL-1/LV-CON2(阴性对照组),利用Western blot方法检测细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。研究结果一、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中的表达情况1、DAL-1蛋白在H520和H460细胞中高表达,在A549、SPCA-1、H1975和H1299细胞中低表达;HSPA5蛋白在非小细胞肺癌细胞中高表达。2、DAL-1蛋白和HSPA5蛋白共定位,主要共定位在细胞浆中。3、DAL-1可下调HSPA5的mRNA和蛋白表达(P<0.05);HSPA5可下调DAL-1的蛋白表达(P<0.05),但对DAL-1的mRNA无明显影响(P>0.05)。二、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞的EMT、增殖、侵袭和迁移的影响1、DAL-1可上调A549细胞的E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达(P<0.05),下调N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达(P<0.05),抑制细胞体外增殖、侵袭和迁移(P<0.05)。2、HSPA5可下调A549细胞的E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达(P<0.05),上调N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达(P<0.05),促进细胞体外增殖、侵袭和迁移(P<0.05)。三、DAL-1是否通过HSPA5影响非小细胞肺癌细胞的EMT、增殖、侵袭和迁移的研究1、A549/LV-DAL-1细胞过表达HSPA5后,E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),细胞体外增殖、侵袭和迁移能力明显增强(P<0.05)。2、A549/LV-DAL-1细胞干扰HSPA5表达后,E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05),细胞体外增殖、侵袭和迁移能力明显减弱(P<0.05)。四、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中对PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路和EMT的影响1、DAL-1下调A549细胞的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达(P<0.05),上调p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达(P<0.05)。2、HSPA5上调A549细胞的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达(P<0.05),下调p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达(P<0.05)。六、DAL-1在非小细胞肺癌细胞中是否通过HSPA5来影响PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路和EMT的研究A549/LV-DAL-1细胞过表达HSPA5后,PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达均上调(P<0.05);p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达均下调(P<0.05)。结论在非小细胞肺癌细胞中:1、DAL-1蛋白和HSPA5蛋白共定位,主要共定位在细胞浆。2、DAL-1可下调HSPA5的mRNA和蛋白表达。3、DAL-1可能通过下调HSPA5表达抑制EMT、增殖、侵袭和迁移。4、DAL-1可能通过下调HSPA5表达下调PI3K、AKT、Mdm2蛋白表达和磷酸化,上调p53蛋白表达,从而抑制EMT。