论文部分内容阅读
目的:多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是中枢神经系统（central nervous system,CNS）白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病。具有反复发作,部分患者病情呈进行性加重的特点。由于MS发病率较高,呈慢性病程且倾向于青年人罹患,使其成为重要的神经系统疾病之一。MS发病机制不确切,尚缺乏行之有效的防治措施,因此通过建立动物模型,探讨MS的发病机制,寻求有效的治疗方案,是我们目前研究的主要方向。胸腺五肽（Thymopoietin,TP-5）是从胸腺激素中分离出来的胸腺生成素Ⅱ功能活性部分,胸腺生成素Ⅱ由49个氨基酸组成,而其中由5个氨基酸组成的肽链片段,有着与胸腺生成素Ⅱ相同的全部生理功能,所以就把这个五肽片段称为胸腺五肽。在实验研究和临床应用中,胸腺五肽均显示出具有调节免疫系统的作用,能诱导T淋巴细胞及其亚群分化和成熟;减少自身抗体的产生;调节T淋巴亚群比例,使CD4+/CD8+趋于正常,免疫系统恢复正常。在某些自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮等）中疗效明显,长期应用耐受良好。但目前国内外应用胸腺五肽治疗EAE/MS尚未见报道。本实验旨在MS的经典动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）基础上,探讨不同剂量的胸腺五肽对EAE的治疗作用及其机制,为脱髓鞘疾病的研究提供新的思路。方法:1动物分组:将78只6～8周龄雌性Wistar大鼠,体重180～200g,随机分为正常对照组6只,EAE模型组、地塞米松（dexamethasone,DXM）组、TP-5小剂量组(0.05 mg·kg-1·d-1)、TP-5大剂量组(0.25 mg·kg-1·d-1)各18只。每组又随机分为7天、14天、21天三个亚组,每亚组6只大鼠。2模型制备:将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆,加上完全福氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）,佐剂中含卡介苗4 mg/mL,经过乳化后经按0.4 mL/只分别于大鼠四肢足垫皮下注射。药物治疗组于模型制备第一天起给予相应剂量腹腔注射,药物每天一次持续给至动物处死时为止。3神经功能评分:于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用Kono等提出的标准,分为5分:1分动物尾部无力;2分尾部无力+肢体无力;3分肢体轻度麻痹;4分级肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分濒死状态。4组织病理学:分别于免疫后第7天、14天、21天,在动物麻醉状态下,快速取其大脑侧脑室周围及颈、胸、腰膨大处组织,40g/L多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,行HE染色,光学纤维镜下观察炎症细胞浸润情况。5 RT-PCR法检测脑组织IFN-γ、IL-4 mRNA的表达:实验动物于免疫后第7天、14天、21天,在麻醉状态下,快速取大脑侧脑室周围及颈、胸、腰膨大处组织,液氮中保存,Trizol一步法提取CNS组织总RNA,采用随机引物法进行逆转录反应后,扩增获得目的基因IFN-γ、IL-4 RT-PCR产物,以β-actin作为内对照。最后紫外凝胶成像分析系统分析结果。结果:1动物发病率观察:TP-5小剂量组、DXM组低于EAE组及TP-5大剂量组,均有统计学意义（P＜0.01）。DXM组低于TP-5小剂量组,有统计学意义（P＜0.01）。EAE组与TP-5大剂量组之间的发病率没有统计学意义（P＞0.05）。2行为学观察2.1大鼠在发病潜伏期和缓解期时神经功能评分比较:各组之间无明显差别。2.2各组大鼠在发病高峰期时神经功能评分比较:TP-5小剂量组、DXM组各大鼠神经功能评分明显低于EAE组及TP-5大剂量组（P＜0.01）。DXM组明显低于TP-5小剂量组（P＜0.01）。EAE组与TP-5大剂量组之间神经功能评分无明显差别（P＞0.05）。3组织病理学观察:在疾病早期,EAE鼠组织内即出现炎性细胞浸润,且炎性细胞数目的多少与疾病严重程度相一致。在发病高峰期和恢复期,TP-5小剂量组、DXM组炎症细胞浸润形成的血管套袖数目明显低于EAE组及TP-5大剂量组（P＜0.01）。DXM组和TP-5小剂量组,EAE组和TP-5大剂量组炎症细胞浸润形成的血管套袖数目没有统计学意义（P＞0.05）。4 IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达4.1 IFN-γmRNA:除正常对照组外,其余各组IFN-γmRNA在潜伏期即表达上调,随着进入症状高峰期,IFN-γmRNA表达水平亦达高峰,恢复期IFN-γmRNA表达水平下降。在发病高峰期和恢复期,DXM组和TP-5小剂量组IFN-γmRNA表达水平与EAE组及TP-5大剂量组相比明显下降（P＜0.01）。DXM组与TP-5小剂量组间,EAE组和TP-5大剂量组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。4.2 IL-4 mRNA:IL-4 mRNA表达水平呈逐渐升高的趋势,潜伏期和症状高峰期IL-4 mRNA有所表达,恢复期达峰值。在发病高峰期和恢复期,DXM组和TP-5小剂量组IL-4mRNA表达明显高于EAE组（P＜0.01）,DXM组与TP-5小剂量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1胸腺五肽可以降低EAE大鼠的发病率,减少疾病对机体的神经功能损害。2胸腺五肽可以减少EAE大鼠脑组织IFN-γmRNA的表达,减少中枢神经系统内炎症细胞浸润的程度。3胸腺五肽可以提高EAE大鼠脑组织IL-4 mRNA表达,促进病情缓解。4胸腺五肽对MS的治疗作用不呈剂量依赖性。5胸腺五肽与地塞米松比较,虽然地塞米松在发病率和神经功能评分上优于胸腺五肽,但是由于胸腺五肽可以避免长期应用地塞米松引起的不良反应,充分显示出应用安全和耐受性良好的优势。