背景:在我国肝纤维化发生率高,是肝硬化发展的必经环节。目前研究认为肝纤维化属于可逆性病变,因此阻止和延缓肝纤维化的发生、发展则是治疗肝硬化的关键。研究发现在致肝纤维化的细胞因子中最重要是转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β),其致纤信号传导通路已阐明:首先活化了的TGF-β与II型TGF-β受体(TβRⅠI)结合并使之磷酸化而具有激酶活性;与TGF-β结合的TβRⅠI再结合I型TGF-β受体(TβRⅠ)形成I、II型受体复合物,并使TβRⅠ磷酸化具有激酶活性;最后,激活的TβRⅠ激活酶磷酸化其特殊的受体Smads (R-Smads) ,从而调节肝星形细胞(HSC)的转化和ECM的合成、降解。即TGF-β发挥作用必须借助其在细胞膜上的跨膜受体TβRⅠ和TβRⅠI。故从理论上,可推测选择性抑制TβRⅠ的表达,应可影响TGF-β信号传导,从而抑制TGF-β的促纤维化作用。在正常肝脏中,基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotei-nases,MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metallopropteinases,TIMPs)处于动态平衡的状态,维持了胶原的产生与降解之间的平衡。当有损伤因子作用于肝脏,使HSC活化,打破了MMPs与TIMPs的平衡,就会导致胶原纤维降解的减少,致使大量的胶原在肝组织中沉积。肝内主要存在的TIMPs有TIMP-1和TIMP-2,其中以TIMP-1表达更为显著;主要存在的MMPs在人类为MMP-1,在啮齿类动物为MMP-13;TIMP-1可与MMP-1/MMP-13特异性结合,抑制其活性。故推测,抑制TIMP-1的表达,可减轻TIMP-1对MMP-1/MMP-13的抑制作用,增加ECM的降解,减少ECM的沉积,延缓肝纤维化的发生、发展。本实验旨在前期研究的基础上,应用分子生物学检测技术RT-PCR和western–bloting(蛋白印迹)测定各实验模型组大鼠肝组织TβRⅠ,TβRⅡ和TIMP-1,MMP-13 mRNA含量及蛋白的表达,并对所得数据进行科学分析,从生物分子的角度阐述并验证本课题,反义转化生长因子受体与反义基质蛋白酶抑制因子联合作能够有效的干预肝纤维化的发生,发展。最终的目标是运用基因治疗技术寻找一种防止和延缓各种慢性肝病向肝纤硬化发展的有效方法,为今后人类肝纤维化基因治疗奠定基础。材料与方法:取-80℃低温保存的实验大鼠肝脏:正常对照组12例,模型对照组12例、空质粒组13例、反义TIMP-1真核表达质粒组13例,反义TβRⅠ治疗组13例,反义TβRⅡ治疗组13例,反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组13例:反义TβRⅡ治疗组+反义TIMP-1治疗组13例。1.运用RT-PCR半定量检测肝组织内TβRⅠmRNA、TβRⅡmRNA、TIMP-1mRNA、MMP-13 mRNA测定。2.western blot蛋白印记技术检测大鼠肝组织中TβRⅠ、TβRⅡ、TIMP-1、MMP-13蛋白表达。3.进行系统科学数据分析,论证。结果:与模型对照组和空质粒组相比,反义TβRⅠ治疗组,反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组、反义TIMP-1治疗组、反义TβRⅡ治疗组、反义TβRⅡ+反义TIMP-1各治疗组中的TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达均有下降,各组比对均有统计学意义(P<0.05)。在正常对照组与各实验治疗组之间TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达均有显著性差异(P<0.05);反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组较反义TβRⅠ治疗组、反义TIMP-1治疗组比对有统计学意义(P<0.05);反义TβRⅡ+反义TIMP-1各治疗组较反义TβRⅡ治疗组,反义TIMP-1治疗组比对有统计学意义(P<0.05)模型对照组和空质粒对照组之间TβRⅠ、TβRⅡ及TIMP-1 mRNA含量及蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。结论:1、反义TβRⅠ、TβRⅡ真核细胞表达质粒通过阻断TGF-β1的作用通道,减少细胞外间质(ECM)的合成,减轻肝纤维化的发展;通过实验也验证了TGF-β信号通路的存在。2、反义TβRⅠ、TβRⅡ真核细胞通过阻断TGF-β1的作用通道,对MMP-13产生抑制作用,对TIMP-1的促进作用,间接使细胞外间质(ECM)降解增加,抑制肝纤维化的进程。3、反义TIMP-1真核细胞通过拮抗TIMP-1对MMP-13的抑制作用,使细胞外间质(ECM)降解增加。4、两种重组质粒协同作用,可产生叠加效应,达到有效抑制延缓肝纤维化发生的目的。最终的目的是寻求一种防止和延缓各种慢性肝病向肝硬化发展的有效方法。