生物体内的核酸酶在生命活动的不同时期对基因调控具有重要的生理意义，因此对核酸酶性质的研究始终是人们关心的问题。在研究核酸酶的领域中，主要的研究手段有以X射线晶体衍射法为代表的结构解析技术以及以核酸探针荧光光谱法为代表的体外活性表征等方法。结构解析方法可以获得详细的分子结构信息，但是对于酶催化反应的机理研究缺少直观的研究模型，并且对于核酸酶在细胞内的调控机制的研究更是无能为力。活性表征方法可以实现酶活性定量及抑制剂筛选等，然而对于复杂的生物样品环境，现有的核酸探针大多无法应对复杂背景的干扰。由于核酸自身易降解或易被大分子结合的性质导致的假阳性和假阴性信号的问题一直缺乏有效的解决办法。针对以上这些问题，本文以开发出可以简单、快速、灵敏地检测出生物背景样品中核酸酶活性的方法为目标，构建了一系列结构新颖的荧光核酸探针，初步实现了活细胞内核酸酶的原位荧光成像，并通过对核酸探针结构的修饰，对核酸酶催化反应的影响因素进行了初步研究。本研究分为三个部分：　　第一部分建立了一种体外磷酸酶活性的定量分析方法，并且将该方法用于拟南芥组织提取样品中碱性磷酸酶活性的定量分析。该方法设计合成了一个两端双自杂交的单链DNA探针结构。在核酸链的3’末端设计碱性磷酸酶的识别和作用位点。在与目标酶反应后，探针生成的产物进一步通过聚合酶延伸作用使原有的自杂交结构打开，导致原本位置接近的荧光基团与猝灭基团分离，产生荧光信号，从而实现目标酶的实时快速检测。该探针既是碱性磷酸酶的作用底物又是信号产生分子，从而使检测体系简便，易于向实际样品检测方向推广。之后，进一步改进探针结构提高产物的荧光信号强度并采用无标记底物类似物竞争的方法抑制样品中非特异性酶解反应的干扰。方法成功用于拟南芥组织提取样品中碱性磷酸酶活性的快速定量检测。　　第二部分建立了一种非特异性内切酶Ⅰ(DNaseⅠ)活性的定量分析方法，并将其用于鼠血清样品中DNaseⅠ活性的定量测定以及HeLa细胞内DNaseⅠ的原位荧光成像。该方法设计合成了一段单链自杂交DNA链，并通过化学修饰的方法将单链两端的核酸骨架磷硫代标记。这样设计的探针可以抵抗各种单链及双链外切酶的作用，并且对于单链结合蛋白这种假阳性信号的重要产生来源有显著抑制作用。这种方法可以直接在稀释后的鼠血清样品中定量检测DNaseⅠ活性。通过阴性探针对比证实在HeLa细胞内部可以对DNaseⅠ进行活性成像，并且可以在药物诱导细胞凋亡过程中检测到被输送到细胞核内的DNaseⅠ活性。本方法对于体内核酸酶的代谢规律研究提供了重要的研究手段。另外，基于构建成功的DNaseⅠ检测体系，再引入另一个仅对外切酶Ⅲ(ExoⅢ)具有响应的单链自杂交DNA探针，通过采用不同荧光标记的方法初步构建了体外DNaseⅠ和ExoⅢ同时定量检出的体系，方法有望实现HeLa细胞内两种目标酶的同时荧光成像。　　第三部分研究了细胞损伤修复酶内切酶Ⅳ(EndoⅣ)的催化反应速率对底物结构变化的响应性质。该方法设计了一条含有脱碱基位点的单链荧光探针，通过对探针互补链空位对面的几个核苷酸进行官能团修饰，研究了底物结构的微小改变对EndoⅣ催化反应速率的影响。利用EndoⅣ对互补链放大检测的性质，将底物甲基化修饰的差异进一步放大，使方法初步具备定性判断核酸甲基化的能力。同时，利用单链核酸探针与EndoⅣ的相互作用实现了鸟嘌呤碱基与其它碱基的特异性区分。该方法进一步扩充了核酸探针的应用范围，为核酸酶催化反应机理的研究提供了新的思路。本研究实现了生物样品中核酸酶活性的直接定量检测，对核酸酶活性进行深入探讨，为生命科学研究和相关疾病的诊断与治疗提供了可靠的分析方法。