研究背景和目的　　食管癌是常见的消化道肿瘤，其发病率在世界上位于第七位，致死率位于第六位。在我国，食管癌的发病率位于第三位，致死率位于第四位。　　近年来，研究特异靶向肿瘤干细胞的治疗方法已成为肿瘤研究的热点之一。由于肿瘤干细胞可以自我更新，对放化疗不敏感，常规的治疗虽然会导致肿瘤体积的缩小或肉眼消失，但治疗后残存的肿瘤干细胞可以形成新的肿瘤，引起肿瘤的复发。因此，探究肿瘤干细胞的自我更新调控机制十分重要。　　食管癌干细胞缺乏特异的表面标志物，在前期研究中，我们实验室已经利用侧群细胞分选法从食管癌细胞系中分离和识别 SP细胞，并且证明SP细胞与肿瘤干细胞具有某些共同的特征,如自我更新的能力、高度增殖、肿瘤发生的能力和对化疗药物的抵抗性。因此我们认为SP细胞富集了食管癌干细胞。经过基因芯片和测序分析，我们发现在食管癌SP细胞和NSP细胞中存在许多差异表达的基因，其中TM4SF1在SP细胞中高表达。　　TM4SF1是一个四跨膜的小分子蛋白，在甲状腺癌干细胞和骨髓间充质干细胞中，可以作为单独的表面蛋白的标记物。目前，已有研究在胰腺癌中证实TM4SF1是miR-141的靶基因。而miR-141是miR-200家族的一员，有大量研究报道这个家族在干细胞干性维持中起着非常重要的作用。因此，结合我们前期的研究，在食管癌中TM4SF1和miR-141之间是怎样的关系，它们对食管癌干细胞又起到什么作用呢？这值得我们进行深入的探讨。　　本研究中我们首先验证了TM4SF1和miR-141在食管肿瘤干细胞中的表达情况，随后研究了TM4SF1和miR-141在食管癌细胞的关系，并探讨了TM4SF1和 miR-141对肿瘤干细胞的自我更新和致癌性的调控作用及机制。研究共分为五个部分。　　第一部分：TM4SF1和miR-141在食管癌和食管癌干细胞中的表达　　方法：　　1．收集115对食管癌组织和癌旁组织的标本，采用RT-PCR比较TM4SF1在食管癌组织和癌旁组织的表达差异。　　2．流式细胞分选法检测KYSE150和KYSE180细胞中SP的比例，分别收集富集食管癌干细胞的SP细胞和NSP细胞。　　3．提取RNA和蛋白，采用RT-PCR和western blot检测TM4SF1mRNA和TM4SF1蛋白在SP细胞和NSP细胞的表达。　　4．RT-PCR检测miR-141在在SP细胞和NSP细胞的表达。　　5．统计学分析：利用SPSS17.0软件，计量资料采用t检验；RT-PCR结果采用方差分析，以P﹤0.05作为有统计学意义。　　结果：　　1．RT-PCR结果显示：TM4SF1在115对食管癌组织和癌旁组织中的表达没有明显差异。　　2．KYSE150和 KYSE180中都存在 SP细胞，比例分别为0.9％±0.2和0.7%±0.2。　　3．在KYSE150和KYSE180细胞中，TM4SF1 mRNA在SP细胞中高表达，在NSP细胞中低表达；TM4SF1蛋白在SP细胞中均较NSP细胞高表达。　　4．在KYSE150和KYSE180细胞中，miR-141在SP细胞中低表达，在NSP细胞中高表达。　　第二部分：TM4SF1调控食管癌干细胞的自我更新与致癌性　　方法：　　1．siRNA和TM4SF1质粒转染KYSE150细胞，western blot验证转染效果。　　2．流式检测KYSE150、pENTER、pENTER-TM4SF1、NCsiRNA、DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3各组细胞SP比例。　　3．CCK8法检测上述各组细胞生长能力。　　4．DDP作用后48h，CCK8法检测上述各组细胞的细胞存活数。　　5．Transwell小室实验比较上述各组细胞迁移侵袭能力。　　6．体外克隆形成实验比较上述各组细胞的克隆形成能力。　　7．构建慢病毒载体，包装过表达和沉默 TM4SF1的慢病毒，分别转染KYSE150细胞，建立稳转的 Lenti-TM4SF1、Lenti-NC、Lenti-shRNA1、Lenti-shRNA2、Lenti-shNC细胞系，western blot验证转染效果。　　8．裸鼠成瘤实验，比较7中提到的各组细胞形成的瘤重。　　9．统计学分析：利用SPSS17.0软件，计量资料采用t检验；肿瘤质量组间比较采用方差分析，以P﹤0.05作为有统计学意义。　　结果：　　1．siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3和TM4SF1质粒转染KYSE150细胞是有效的，TM4SF1蛋白表达量发生了相应改变。　　2．pENTER-TM4SF1组 SP比例增高，DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3组SP比例降低，差异有统计学意义。　　3．上述各组细胞生长曲线没有明显差异。　　4．pENTER-TM4SF1组细胞存活数明显高于 KYSE150和 pENTER组。DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3组细胞存活数明显低于KYSE150和NCsiRNA组，差异均有统计学意义。　　5．pENTER-TM4SF1组细胞迁移和侵袭能力增强，DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3组迁移和侵袭能力减弱，差异均有统计学意义。　　6．pENTER-TM4SF1组形成克隆数目明显增多，DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3组形成的克隆数目明显减少，差异均有统计学意义。　　7．成功建立稳定高表达TM4SF1的 Lenti-TM4SF1细胞系和沉默 TM4SF1表达的 Lenti-shRNA1和 Lenti-shRNA2细胞系以及它们的对照组 Lenti-NC和Lenti-shNC细胞系。　　8． Lenti-TM4SF1组形成的瘤重明显高于对照组， Lenti-shRNA1和Lenti-shRNA2组形成的瘤重明显低于对照组，差异均有统计学意义。　　第三部分：miR-141靶向抑制TM4SF1的表达　　方法：　　1．Target Scan6.0预测TM4SF1和miR-141的靶结合位点。　　2．化学合成的 hsa-miR-141 mimics和对照 NC-mimics转染 KYSE150， RT-PCR验证转染后 miR-141的表达水平，western blot检测转染后各组细胞TM4SF1蛋白的表达。　　3．构建TM4SF13’UTR及TM4SF13’UTRmut荧光素酶报告基因质粒，在转染了hsa-miR-141 mimics和NC-mimics的KYSE150细胞中进行荧光素酶报告实验。　　4． miR-141 up慢病毒和阴性对照病毒转染KYSE150细胞， RT-PCR验证miR-141表达情况。　　5．Western blot检测TM4SF1在Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150细胞中的表达情况。　　6．在Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150中进行荧光素酶报告实验。　　7．统计学分析：利用SPSS17.0软件，计量资料采用t检验；RT-PCR结果采用方差分析，以P﹤0.05作为有统计学意义。　　结果：　　1．TM4SF1的3’UTR在+157～+163bp有一个miR-141的保守结合位点。　　2．转染了化学合成的hsa-miR-141 mimics后KYSE150中miR-141表达水平较NC和亲本KYSE150组表达水平增高，TM4SF1蛋白表达降低。　　3．在 KYSE150、miR-141 mimics、NC mimics三组细胞中，转染了TM4SF1-3’UTR与转染 pIS0空载相比，都出现了报告基因活性的降低。在miR-141 mimics组细胞中转染TM4SF1-3’UTR的报告基因的活性与对照细胞相比显著下降。在 KYSE150、miR-141 mimics、NC mimics三组细胞中，转染TM4SF1-3’UTRmut质粒后与转染TM4SF1-3’UTR质粒相比报告基因的活性都有一定的升高，结果有统计学意义。　　4．Lenti-miR-141与对照Lenti-GFP和亲本KYSE150细胞相比，可以高表达miR-141。　　5．Lenti-miR-141与Lenti-GFP和亲本KYSE150细胞相比，TM4SF1蛋白的表达量显著下降。　　6．与转染pIS0空载的细胞相比，其它各组转染了TM4SF1-3’UTR的报告基因活性均有不同程度的降低。对于 Lenti-miR-141细胞来说，转染TM4SF1-3’UTR的报告基因的活性与对照细胞相比显著下降。在三组细胞中转染TM4SF1-3’UTRmut质粒后，与转染TM4SF1-3’UTR质粒相比，报告基因的活性都有不同程度的升高，差异具有统计学意义。　　第四部分：miR-141调控食管癌干细胞的自我更新与致癌性　　方法：　　1．流式分选法检测Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150细胞SP比例。　　2．CCK8法检测Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150细胞生长能力。　　3．DDP作用48h后，CCK8法检测Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150细胞存活数。　　4．Transewell小室实验比较Lenti-miR-141、Lenti-GFP和KYSE150组细胞迁移和侵袭能力。　　5．体外平板克隆实验比较Lenti-miR-141、Lenti-GFP、KYSE150细胞的克隆形成能力。　　6．裸鼠体内成瘤性实验，比较3组细胞形成的瘤重。　　7．统计学分析：利用SPSS17.0软件，计量资料采用t检验；肿瘤质量的组间比较采用方差分析，P﹤0.05认为有统计学意义。　　结果：　　1．Lenti-miR-141组SP比例和Lenti-GFP组、KYSE150组相比明显降低，差异有统计学意义。　　2．3组细胞生长曲线没有明显差异。　　3．DDP作用后，Lenti-miR-141组和Lenti-GFP组、KYSE150组相比细胞存活数较少，差异有统计学意义。　　4．Lenti-miR-141组和Lenti-GFP组、KYSE150组相比细胞迁移和侵袭能力减弱，差异有统计学意义。　　5．Lenti-miR-141组和Lenti-GFP组、KYSE150组相比形成克隆数目明显减少，差异有统计学意义。　　6．Lenti-miR-141组的瘤重明显低于Lenti-GFP组和KYSE150组，差异有统计学意义。　　第五部分：miR-141通过抑制TM4SF1调控食管癌干细胞　　方法：　　1．在Lenti-miR-141细胞株中转入TM4SF1质粒，Lenti-GFP组、KYSE150细胞中转入siRNA1，western blot检测TM4SF1蛋白的表达。　　2．流式分选方法检测各组细胞SP比例。　　3．平板克隆形成实验比较各组细胞形成克隆数目。　　结果：　　1．Lenti-miR-141细胞株中转入TM4SF1质粒，TM4SF1蛋白表达水平恢复。　　2．Lenti-miR-141细胞株中转入TM4SF1质粒，SP比例恢复。　　3．Lenti-miR-141细胞株中转入TM4SF1质粒，克隆形成能力恢复。　　结论：　　1．TM4SF1在食管癌干细胞中高表达，miR-141在食管癌干细胞中低表达；二者均影响食管癌干细胞的自我更新和致癌性。　　2．TM4SF1是miR-141的下游靶基因，TM4SF1的表达受miR-141调控。　　3．TM4SF1的表达水平可以影响食管癌细胞中的肿瘤干细胞的表型变化， TM4SF1表达越高，SP比例越高。在体外实验中，TM4SF1高表达可增加细胞对化疗药物抵抗性，增强食管癌细胞的侵袭和迁移能力，增强克隆形成能力，在体内可以促进裸鼠成瘤能力。反之亦然。　　4．miR-141高表达可以降低食管肿瘤干细胞的比例。在体外实验中，miR-141高表达，增强细胞对化疗药物敏感性，抑制食管癌细胞的侵袭和迁移能力，降低克隆形成能力，在体内可以抑制裸鼠成瘤能力。　　5．miR-141通过抑制TM4SF1的表达，影响食管癌干细胞的自我更新和致癌性。