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目的:
体外表达linkerl连接的hGITR胞外段、跨膜转导结构域(PTD)和白喉毒素A片段(DTA)重组蛋白(hGITR-PTD-DTA)及其对照蛋白PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP,并研究hGITR-PTD-DTA对人肺腺癌A549细胞株的杀伤作用。
方法:
(1)首先运用PCR扩增技术检测多种人类肿瘤细胞细胞株hGITRLmRNA的表达,流式细胞术检测肿瘤细胞株表面GITRL蛋白的表达。
(2)应用PCR技术,以pGEM-T-GITR为模板,扩增获得hGITR胞外段基因；以p22EDT1(含DTA)质粒和pUC57质粒(含有人工合成的linker和PTD氨基酸序列推算出核苷酸序列并在3端加上SalⅠ和DTA5’端25个核苷酸)同时为模板,扩增获得linker-PTD-DTA基因；以pIRES2-eGFP质粒为模板,获得eGFP基因；对以上扩增获得的目的基因分别进行T-A克隆。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切hGITR胞外段基因,用HindⅢ和XhoⅠ双酶切linker-PTD-DTA基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切原核表达载体质粒pET32a(+),连接酶切产物,构建重组质粒pET32a(+)hGITR-PTD-DTA,转化至感受态E.coli DH5α；同时,用HindⅢ和XhoⅠ双酶切linker-PTD-DTA基因,和pET32a(+),连接酶切产物,构建重组质粒pET32a(+)PTD—DTA,转化感受态E.coliDH5α；分别挑取阳性克隆,经双酶切、PCR和基因测序进行鉴定。然后,用SalⅠ和XhoⅠ双酶切eGFP T-A克隆质粒和pET32a(+)hGITR-PTD-DTA,连接酶切产物,构建重组质粒pET32a(-)hGITR-PTD-eGFP,转化感受态E.coli DH5α；挑取阳性克隆,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR和基因测序进行鉴定。将构建的表达质粒分别转化ROS表达工程菌,利用IPTG诱导蛋白表达。
(3)诱导表达的蛋白hGITR-PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP带有His标签,分别通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。然后通过Ni+-IMAC柱分别对hGITR—PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP进行纯化。
(4)将对照蛋白hGITR-PTD-eGFP和人肺腺癌A549细胞株共同孵育,用倒置荧光显微镜观察融合蛋白hGITR-PTD-eGFP和A549细胞的结合情况。
(5)采用MTT法测定融合蛋白hGITR—PTD-DTA对肿瘤细胞的体外杀伤活性,利用人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤模型来评价融合蛋白hGITR-PTD-DTA对肿瘤细胞的体内杀伤活性。
结果:
(1)运用PCR扩增技术检测,发现有部分人类肿瘤细胞株hGITRLmRNA表达阳性,流式细胞术检测发现人肺腺癌A549细胞株表面表达GITRL蛋白。同时,人肺腺癌A549细胞株能和hGITR蛋白结合。
(2)成功构建原核表达载体pET32a(+)hGITR-PTD-DTA、pET32a(+)PTD—DTA和pET32a(+)hGITR-PTD-eGFP,经PCR和双酶切鉴定分别可见1029bp、675bp和1216bp条带,测序结果与预期完全一致。
(3)将鉴定正确的表达载体导入ROSI程表达菌,以终浓度0.5mmol／L IPTG、30℃、诱导6 h作为最佳蛋白诱导条件。利用超声裂解法裂解菌体,发现诱导表达的hGITR—PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP融合蛋白有部分是可溶性的。通过SDS-PAGE和Western blot证实hGITR-PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP相对分子量分别约为62kDa,42 kDa和66 kDa。
(4)将对照蛋白hGITR-PTD-eGFP和肿瘤细胞株A549共同孵育,倒置荧光显微镜观察发现:融合蛋白hGITR-PTD-eGFP可以和A549细胞结合。
(5)MTT实验结果显示,相对于不表达hGITRL的K562细胞来说,融合蛋白hGITR—PTD-DTA对表达hGITRL的A549细胞的抑制作用较强,对照蛋白PTD-DTA对A549和K562有相对较弱的抑制作用,但hGITR-PTD-eGFP对两种细胞都没有抑制性。融合蛋白hGITR-PTD-DTA对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的治疗结果显示,hGITR-PTD-DTA在剂量为500μg／kg时可明显抑制A549移植瘤的生长。
结论:
我们研究表明在人类的部分肿瘤细胞株表面表达hGITRL蛋白,并且能和GITR蛋白结合。成功制备可溶性的hGITR—PTD-DTA融合蛋白。对照蛋白hGITR-PTD-eGFP可特异地与人肺腺癌A549细胞株结合。在体外培养体系中hGITR-PTD-DTA蛋白对人肺腺癌A549细胞株具有杀伤作用,在体内hGITR—PTD—DTA对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤具有杀伤作用。