PGC-1α及NT-PGC-1α在新生乳鼠心肌细胞中表达的调节机制的研究

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一、研究背景近年来尽管对心力衰竭的治疗取得重大进展,但其死亡率仍然很高,据相关研究显示,纽约心脏病协会心功能(NYHA)Ⅱ-Ⅲ级患者的年死亡率为10-25%,而NYHA分级为Ⅳ级的年患者死亡率则高达40-50%,超过恶性肿瘤的死亡率。表明心力衰竭仍是严重影响公众健康的心血管疾病。随着我国人口老龄化进程的加快,我国心力衰竭患病率也在逐渐增高。心力衰竭的发生机制比较复杂,目前认为导致心力衰竭的基本机制是心室重塑,RAAS系统和交感神经兴奋性增高在其中扮演着重要角色。其他引起心力衰竭的发生机制还有细胞因子紊乱、血管内皮功能失调、细胞凋亡、神经内分泌功能紊乱等病理生理机制的参与。不少研究结果显示心肌细胞能量代谢异常在心衰的发生、发展过程中起着重要作用,既往就曾有学者认为心力衰竭中能量物质的减少是心衰发生的本质,也有人提出"能量消耗导致心力衰竭"的假说。而心肌细胞内线粒体持续生成ATP是心肌细胞维持收缩功能的重要原因之一,也是心脏发挥射血功能的生理基础。心肌细胞内三羧酸循环相关的酶系功能下降可以引起一系列的心肌病变,最常见的表现为扩张型心肌病样改变。临床上应用的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和β受体阻滞剂除能抑制神经内分泌激活外均能一定程度的减轻心肌能量消耗,因此改善心肌能量代谢可能会成为治疗心力衰竭的一个治疗靶点。过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子(PGC-1α)是一个核受体辅助激活因子,主要存在于高能量需求且含线粒体丰富的组织如心脏、骨骼肌、棕色脂肪组织、肝脏、脑等,它能与核受体PPARγ共同作用促进细胞能量代谢,促进细胞氧化磷酸化、改善细胞能量利用、促进线粒体增殖等。近年来研究显示PGC-1α在能量动态平衡、线粒体生物发生、产热调控以及糖脂代谢、抗氧化等重要生理活动中发挥着重要作用,也是心脏发育和心肌能量代谢的关键因子之一。体外实验证实PGC-1α的超表达是转基因小鼠胎儿期线粒体增殖的重要触发因素,相反PGC-1α基因敲除小鼠因胎儿期线粒体停止分化而在出生几天后就死于心力衰竭,心肌病理切片显示PGC-1α基因敲除小鼠心肌内线粒体大量消失,ATP含量明显减少,三羧酸循环相关的酶系表达也明显的下降,由此可见PGC-1α对出生后心肌能量代谢的平衡和心功能的维持发挥着重要的作用。既然心力衰竭发生发展过程中伴随着心肌能量的代谢紊乱,但心力衰竭的发生发展过程中是否伴随着PGC-1α的下降还不明确。虽然诸多动物实验已经证实心力衰竭时体内PGC-1α浓度下降,但激活PGC-1α能否真正达到改善心肌能量代谢、促进线粒体增殖、增强心脏收缩功能,从而治疗心衰目前还不得而知。相关动物实验表明适当的PGC-1α表达增加可以改善心脏收缩功能、促进心肌能量代谢、改善心力衰竭预后,但是在PGC-1α超表达的转基因小鼠体内却发现该类动物心肌细胞过度肥大、线粒体过度增殖、三羧酸循环相关的酶系大量表达,从而引起心脏过度的肥厚及扩张,这就使得人们思考过量的PGC-1α表达可能反而会加重心衰,如此一来如果增加PGC-1α表达真能够治疗心衰,同时精确控制PGC-1α的表达量,避免因PGC-1α长期过度激活所致的副作用则有可能成为今后心力衰竭治疗领域的研究热点。NT-PGC-1α是我国学者张玉彬发现的一种PGC-1α的N端同型异构体,NT-PGC-1α虽然失去PGC-1α的部分C端氨基酸序列,但NT-PGC-1α仍然具有转录激活和核受体结合区,且能与PGC-1α的大部分下游靶点结合,因NT-PGC-1α失去部分C端氨基酸序列,而该段序列中包含有核呼吸因子结合序列。众所周知,核呼吸因子是促进细胞线粒体增殖的重要促发因素,PGC-1α也是依靠NRF发挥其促进线粒体增殖的功能。虽然NT-PGC-1α缺乏C段部分序列,但其N段仍然保留有其他关于三羧酸循环等相关转录因子结合序列。由此推测NT-PGC-1α可能可以作为PGC-1α的有效替代物,同时由于PGC-1α本身在细胞内容易降解、性质较不稳定、长期过量表达可引起扩张型心肌病样变化等副作用,探讨及利用NT-PGC-1α的医学利用价值可能有助于在心力衰竭的诊断及治疗中有一定的临床应用价值。关于细胞内PGC-1α及NT-PGC-1α的表达调控研究文献显示多种因素可以上调PGC-1α的表达。乙酰化和磷酸化作用可以通过转录后调节作用下调PGC-1α表达,如组蛋白脱乙酰酶能使PGC-1α表达下调,作为组蛋白脱乙酰酶的拮抗剂组蛋白乙酰化酶P300则理论上有可能激活PGC-1α的表达,本实验研究选取P300作为PGC-1α的激动剂,探讨P300能否促进心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,并进一步延伸探讨在动物实验中能否使用P300作为PGC-1α及NT-PGC-1α的激动剂来观察PGC-1α及NT-PGC-1α在心力衰竭发生发展中的作用。本实验通过使用作用于PGC-1α不同部位的激动剂后观察细胞内PGC-1α及NT-PGC-1α水平的变化情况,证明P300为PGC-1α及NT-PGC-1α的激动剂,使用P300抑制剂C646探讨P300抑制剂能否进一步阻断由P300介导的PGC-1α及NT-PGC-1α表达,同时探讨心力衰竭病理生理发生过程中最重要的血管紧张素II及其抑制剂对心肌细胞内PGC-1α及NT-PGC-1α表达的影响,为进一步的动物实验及临床相关研究提供基础实验依据。二、研究方法1.心肌细胞分离与培养取新生SD乳鼠心脏,无菌剪剪碎乳鼠心肌组织块,0.25%胰酶4℃过夜10-12小时,次日取0.1%胶原酶Ⅱ行恒温离心分离组织细胞,60-90分钟差速贴壁分离成纤维细胞及心肌细胞。15%FBS-DMEM完全培养基培养24小时,24小时后换液,行相应时间段药物刺激。2.心肌细胞鉴定新生SD乳鼠心肌细胞差速贴壁分离后,心肌细胞接种于含有多聚胶原的载玻片上,15%FBS-DMEM培养48小时,48小时后取下玻片行免疫荧光检查鉴定,鉴定抗体为兔抗大鼠ANP抗体。3.免疫荧光检测目标蛋白表达情况新生SD乳鼠心肌细胞差速贴壁分离后,细胞接种于P3培养皿内,按预先实验方案进行相应分组及刺激,相应时间段后取出样品,4%多聚甲醛固定,以0.1%TrionX-100 清洗,1%BSA 封闭,敷一抗 PGC-1α(1:1000),荧光二抗孵育后进行免疫荧光共聚焦显微成像。4.Western-Bloting检测蛋白表达情况提取细胞总蛋白,BCA蛋白定量法测定样品蛋白质浓度,取等量总蛋白行蛋白电泳、转膜,5%脱脂奶粉或5%BSA室温封闭1小时,4℃一抗PGC-1α孵育过夜,隔日孵育二抗,行免疫印迹成像。β-actin作为系统内参。三、研究结果1.乳鼠心肌细胞在P300的刺激下可以激活心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,P300 抑制剂 C646 可以抑制由 P300 介导的 PGC-1α 及 NT-PGC-1α表达。2.P300及AICAR能够激活心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α;通过免疫荧光检测和Western-Blotting检测,发现P300及AICAR可以激活乳鼠心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α;P300抑制剂C646可以显著的抑制由P300介导的乳鼠心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α;AICAR抑制剂Ara-A可以显著的抑制由AICAR介导的乳鼠心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α3.二甲双胍及血管紧张素Ⅱ可以激活心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α出生后24小时的心肌细胞接受二甲双胍、Ang-Ⅱ刺激,心肌表达PGC-1α及NT-PGC-1α明显增强,氯沙坦可以阻断由Ang-Ⅱ介导的PGC-1α及NT-PGC-1α表达,但是氯沙坦不能阻断由二甲双胍介导的PGC-1α及NT-PGC-1α表达,提示二甲双胍信号传导通路激活目标蛋白表达与RAAS细胞信号传导通路存在不同的激活机制;4.新生乳鼠心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α受到多种因素影响本实验研究发现处于低糖、无血清培养状态下的心肌细胞可以自发的激活心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,在高糖含血清培养基的状态下表达较弱,其他因素如低温等也会激活PGC-1α和NT-PGC-1α表达。四、结 论1.乳鼠心肌细胞在P300的刺激下可以激活心肌细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,P300 抑制剂 C646 可以抑制由 P300 介导的 PGC-1 α 及 NT-PGC-1α表达。2.血管紧张素Ⅱ可激活细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,同理血管紧张素受体阻滞剂可以抑制有血管紧张素Ⅱ受体介导的PGC-1α及NT-PGC-1α表达。3.研究还发现二甲双胍也可以促进细胞表达PGC-1α及NT-PGC-1α,但是氯沙坦不能够阻断二甲双胍信号传导通路,提示二甲双胍和血管紧张素Ⅱ两者激活目的蛋白质表达信号机制不同。4.心肌细胞在低糖、无血清培养条件下可以自身激活PGC-1α及NT-PGC-1α 表达。总之,PGC-1α及NT-PGC-1α的调节机制较为复杂,受多种因素的影响,探讨出有效的激活剂及抑制剂有助于这一重要生理功能的蛋白质在临床医学方面的应用。
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