研究背景膀胱癌主要指膀胱移行上皮细胞癌,又称膀胱尿路上皮癌。其中约75％是局限于膀胱粘膜层(Ta)和粘膜下层(T1)的非肌层浸润癌；尽管可以通过经尿道膀胱镜切除并配合术后腔内化疗灌注治疗,约2／3的患者会出现复发,并且复发患者中15％～30％会进展为更高的病理分期和／或伴有分级升高。除了肿瘤分期和细胞分级,虽然以往的研究已经报道了大量的肿瘤分子标记物可用以预测膀胱癌的预后,但是目前尚未发现一种可靠的预测指标。肌层浸润性膀胱癌占初发膀胱癌的25％,预后较差,5年生存率仅为10％～50％。对伴有转移的晚期浸润性膀胱癌的传统化疗方法是甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星和顺铂联合用药的MVAC方案。该联合化疗方案虽然可以取得46％～60％治疗反应率,但也伴有严重的毒性反应,而且患者经过数疗程治疗后可能出现获得性耐药。近年来,尽管毒性较低的吉西他滨和顺铂新型GC联合方案开始逐渐成为一线的晚期膀胱癌化疗措施,然而该方案治疗反应率并不比传统的MVAC高。因此,寻找新的治疗晚期膀胱癌的化疗方法已经成为近期研究的热点,以求在减低化疗毒性的基础上提高疗效,为患者延长生存时间并争取更好的生活质量。纺锤体驱动蛋白Eg5在细胞有丝分裂过程中发挥关键作用,近年来成为了靶向抗癌治疗的研究热点。Eg5在增殖组织细胞中表达,其主要功能与双极纺锤体的形成和分离有关,在细胞有丝分裂早期中起到了关键作用。研究已经证实Eg5蛋白在恶性组织中存在高表达,但是在有丝分裂后分化稳定的成熟组织细胞中不表达,如中枢神经系统细胞。研究结果证实Eg5作为新的特异性抗有丝分裂药物的靶点进行抗癌治疗时,不会对神经细胞造成直接损害而出现类似于抗微管药物的神经病变副作用。研究也表明Eg5与肿瘤的发生和发展密切相关,而且最近的临床研究还提示Eg5在恶性肿瘤组织中的表达水平与化疗疗效以及患者的预后密切相关。1999年研究发现了第一个Eg5蛋白小分子抑制剂monastrol, monastrol能特异地与驱动蛋白Eg5结合并抑制Eg5功能,从而使细胞有丝分裂停滞,具有强烈抑制哺乳动物细胞分裂增殖的作用。Monastrol不抑制其他的驱动蛋白活性功能,从而具有较少的副作用和广泛的抗肿瘤作用。以上的特点均促使近年来大量研究集中在研制Eg5抑制剂作为新的抗有丝分裂化疗药物应用上,并取得了很多令人兴奋的结果,临床试验也已经用来检验Eg5抑制剂的抗癌效果。2004年Dimitrios A等首先证实了STLC是作用于Eg5靶点的强有力的小分子抑制剂,与monastrol具有相同的Eg5结合位点,且结合牢固、特异性高,对细胞生长的抑制能力提高了36倍。日本京都大学对STLC的衍生物进行研究后首先报道了S(MeO)TLC是一种强有力的小分子细胞渗透性Eg5抑制剂,抑制细胞生长的能力比STLC提高了10倍,而且S(MeO)TLC与STLC一样具有特异性强的特点。此外,京都大学药学部最近又研制了多种联芳类Eg5抑制剂。如上所述,Eg5与恶性肿瘤的发生、发展有关,已经有多种Eg5小分子抑制剂成为靶向抗癌药物的研究热点,但是目前还没有Eg5蛋白表达与膀胱癌生物学行为以及临床预后的相关性研究,也没有Eg5蛋白抑制剂治疗膀胱癌的系统研究。所以,在本次研究中,研究者通过山东海外留学联合培养项目,在山东大学附属省立医院和日本京都大学医学部对Eg5蛋白表达与膀胱癌关系以及5种Eg5抑制剂(STLC、S(MeO)TLC、KPYC10665、KPYC1066和KPYC 10728)治疗膀胱癌的疗效进行了研究。从而为膀胱肿瘤的临床诊断、预后判断以及化学治疗提供有效地新型方法。目的本研究首先探讨Eg5蛋白表达水平与与膀胱癌生物学行为以及非肌层浸润癌患者术后预后间关系的探讨；并进一步研究新型的Eg5蛋白抑制剂对膀胱癌的治疗效果,尤其是针对晚期转移癌的疗效。方法(1)采用免疫组织化学染色的方法检测了193例膀胱癌临床标本中的Eg5表达(分级：1级32例,2级98例,3级63例：分期：Ta期49例,T1期114例,T2～T4期30例),分析Eg5表达水平与肿瘤生物学行为指标之间的关系,并通过生存分析研究了Eg5表达水平与163例非肌层浸润膀胱癌患者经膀胱镜电切治疗后的预后问关系。(2)培养膀胱癌细胞并通过免疫印迹方法检测各种细胞株中Eg5蛋白表达水平,包括RT112、KU7、RT4、EJ细胞等；同时通过免疫印迹方法检测正常膀胱粘膜、高分级和低分级膀胱癌组织标本中Eg5表达水平。(3)体外实验：采用MTT及台盼兰染色细胞活性实验对比S(MeO)TLC及其他4种Eg5抑制剂(KPYC 10665、KPYC 10666、KPYC 10728和STLC)对膀胱癌细胞增殖的抑制能力,并进一步通过Heochst细胞凋亡实验和流式细胞仪检测药物诱导细胞凋亡的效果和机制。采用细胞免疫荧光技术和免疫印迹技术检测Caspase凋亡通路蛋白,探讨S(MeO)TLC诱导膀胱癌凋亡的分子通路机制。(4)体内实验：采用KU7细胞株建立裸鼠膀胱癌模型,包括皮下肿瘤模型与全身多发转移癌模型,研究药物的体内抗癌疗效；通过经腹腔注射Eg5抑制剂,观察药物抑制膀胱癌皮下肿瘤生长情况,并通过活体体内成像系统(IVIS)检测S(MeO)TLC治疗晚期转移癌的疗效。结果(1)Eg5的表达与肿瘤床分级(P=0.002)和分期(P=0.021)显著相关。163例非肌层浸润膀胱癌患者术后平均随访32.52m(6～72m),Kaplan-Meier单因素变量分析表明Eg5强表达患者无复发生存期显著降低(P=0.012),而对肿瘤复发时临床进展时间的影响未达显著水平(P=0.070)。但是针对高风险的T1期膀胱癌患者,单因素变量分析表明Eg5强表达复发患者无肿瘤进展生存期呈显著降低(P=0.041)。随后的Cox风险模型多因素分析显示膀胱癌细胞分级(P=0.045)以及Eg5表达水平(P=0.029)是预测非肌层浸润癌患者术后复发时间的独立预后因素。(2)蛋白免疫印迹检测各种膀胱癌细胞株均表达Eg5,且浸润性来源细胞株表达较强；正常膀胱粘膜不表达Eg5蛋白,高分级肿瘤表达高于低分级肿瘤。(P<0.05)(3)体外实验表明S(MeO)TLC在5种被检测的Eg5抑制剂具有最强的细胞增殖抑制作用,导致细胞有丝分裂停滞形成单极纺锤体细胞,进而同时激活内源性和外源性Caspase依赖性凋亡途径诱导细胞发生凋亡。(4)体内试验结果表明S(MeO)TLC能有效地抑制皮下肿瘤的生长(P<0.05),20mg/kg S(MeO)TLC治疗组肿瘤可出现明显坏死。S(MeO)TLC能有效抑制晚期膀胱癌转移灶的生长；与对照组小鼠相比,治疗组小鼠的生存时间显著延长(P<0.001)。结论(1)膀胱癌Eg5强表达患者肿瘤分化较差且高表达T1期患者可能具有较早的进展风险,Eg5表达水平是预测非肌层浸润膀胱癌患者术后早期复发的独立预后因素。(2) S(MeO)TLC作为新型的Eg5蛋白靶向抑制剂,能显著抑制体内膀胱肿瘤生长,尤其是对已经出现转移的晚期膀胱癌具有很好的治疗效果。创新及意义(1)国内外首次研究了Eg5蛋白表达水平与膀胱癌生物学行为和非肌层浸润膀胱癌术后预后之间关系。为膀胱癌临床诊断以及预后判断提供依据。(2)国内外首次证实了Eg5蛋白可以作为膀胱癌治疗的有效靶点；并首次对S(MeO)TLC治疗恶性肿瘤的实验疗效进行了研究；首次研究了Eg5抑制剂治疗膀胱癌的抗癌疗效,尤其是晚期转移癌的治疗作用。可为膀胱癌晚期转移提供创新性的靶向化疗方案。(3)国内外首次通过活体体内成像系统(IVIS)评估Eg5蛋白抑制剂治疗晚期转移癌疗效,有助于晚期转移癌治疗相关实验研究方法的开展。