腹泻是目前全世界比较常见的一类肠道疾病,给人类健康带来巨大的威胁。腹泻容易侵犯儿童和老年群体,急性腹泻是世界范围内尤其是欠发达国家婴幼儿常见的疾病,是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。病原微生物感染(包括细菌、病毒、真菌和寄生虫)是引起腹泻的重要病因,其中病毒感染则是最主要的病因,在儿童群体常引起散发或暴发性腹泻。随着经济实力不断发展、医疗卫生条件的不断改善和饮水和卫生条件的大力改善,人类已经开发大量有效用于治疗细菌性腹泻的抗生素,而病毒感染导致的腹泻尚未得到有效控制和关注,从而致使细菌性腹泻的发病率逐渐少于病毒性腹泻,病毒性腹泻的致病病原体仍然没有得到清晰阐明。因此,了解和掌握腹泻病毒的组成及流行情况,对于防控及治疗病毒性腹泻具有重要的意义。目前传统的病毒鉴定及检测方法主要针对已知或变异度较小的病毒,在未知或新型病毒导致的新发传染病病原体确认上具有较大的局限性;近年来,随着分子生物学技术的发展及挖掘新病毒的需求,一大批非培养依赖的病毒挖掘及鉴定技术应运而生,而其中病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)逐渐显示出其巨大的优越性,已经成为未知新型病毒确认的的重要手段。本研究的主要目的是采用病毒宏基因组学方法分析腹泻儿童群体中病毒群落的组成,同时对新型致腹泻病毒病毒进化和遗传关系进行研究,为新型病毒引起的急性腹泻的预防、诊断和治疗奠定基础,对未来新型病毒引起相关疾病病原体的快速确认具有重要的实际意义。本研究主要内容和结果如下:(一)儿童腹泻肠道病毒群落的组成利用非培养依赖的病毒组学研究方法,采集腹泻儿童粪便样品,构建适用于Illumina Miseq平台的病毒组基因组文库,利用Miseq平台进行高通量测序,获得原始文库核酸数据之后,进行一系列基于病毒核酸信息的生物信息学分析,结果显示,儿童腹泻粪便样品中病毒群落组成如下:腺病毒科(Adenoviridae),指环病毒科(Anelloviridae),杯状病毒科(Caliciviridae),细小病毒科(Parvoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼肠孤病毒科(Reoviridae),星状病毒科(Astroviridae),双小RNA病毒科(Picornaviridae),短尾噬菌体科(podoviridae),环状病毒科(circoviridae),二顺反子病毒科(dicistroviridae),藻类去氧核糖核酸病毒科(phycodnaviridae),痘病毒科(poxviridae),逆转录病毒科(retroviridae),番茄丛矮病毒科(tombusviridae),杆状病毒科(baculovoridae),疱疹病毒科(herpesviriade),微小噬菌体科(microviridae),虹彩病毒科(iridoviridae),乳头瘤病毒科(papillomaviridae),人类内源性逆转录病毒科(herv),黄病毒科(flaviviridae),冠状病毒科(coronaviridae),蒂状病毒科(virgaviridae)以及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示:(1)儿童肠道病毒群落组成能与腹泻相关的病毒包括有杯状病毒科、星状病毒科、细小病毒科、双小rna病毒科、小rna病毒科、副肠孤病毒科,病毒文库滴度分析结果显示,这些病毒类群构成儿童腹泻病毒群落的构成了病毒群落的主体;(2)病毒滴度分析结果显示diafeces05-diafeces09病毒文库中所含病毒滴度较高,病毒种类较多。而diafeces01-04和diafeces10病毒滴度较小;(3)在以前的引起腹泻的主要病原体为杯状病毒科,虽然在本次江苏局部地区的儿童腹泻肠道病毒群落组成杯装病毒科仍占有一半以上的比例,但是此次研究杯状病毒科不是导致腹泻病因。(二)儿童腹泻肠道内一种新型人类双埃可病毒(humanparechovirus)的鉴定(1)新型hpev的基因组结构及遗传特征分析基于腹泻儿童病毒群落内各病毒基因组序列的生物信息学分析显示,在儿童腹泻的粪便样品中发现一株新型人类双埃可病毒hpev(命名为ch-zxy1),在遗传关系上与已知病毒具有较大的分歧度,可能为新型hpev毒株。因此,利用相关信息学软件如geneious中的assembly功能和基于病毒基因组的genomemapping方法,获得了该病毒的全基因组序列,该全基因组序列进一步经过普通pcr法确认。结果显示,ch-zxy1全基因组序列为7,213nt,基于ch-zxy1全基因组序列系统进化树显示ch-zxy1和hpev5ch-zi1聚集形成了单独的一个进化枝;基于ch-zxy1毒株全基因组序列在genebank中blastn结果显示ch-zxy1与hpev5ch-zj1序列相似度为84%。本研究基于hpev病毒的3个主要基因(p1、p2及p3)进行系统进化树分析,基于3个不同基因区域系统进化树显示ch-zxy1毒株分别和hpev5ch-zj1,hpev4fuk2005-123,hpev1kvp6紧密激烈;进而基于p1、p2和p3区域的核苷酸序列在genebank中做blastn搜索,结果显示ch-zxy1分别与p1,p2,p3核苷酸序列在genebank中blastn的结果显示显hpev5ch-zj1,hpev4fuk2005-123,hpev1kvp6人类双埃可病毒的序列相似度最高,分别为82.8%,83%,91%。基于ch-zxy1基因组的系统进化及序列分析结果显示,该毒株的不同基因区域与其他的毒株的遗传关系不尽相同,暗示该毒株可能存在基因组同源重组可能。(2)hpev病毒重组分析基于本研究发现的hpev毒株ch-zxy1及genbank检索的相关毒株全基因组序列,进行病毒基因同源重组分析,分析结果显示ch-zxy1可能为重组毒株,该重组事件发生在hpev1代表毒株br/53/2006(hq696575)和hpev5代表毒株bni-788st(ef051629)之间。基于基因同源重组断裂点两端的基因序列分别进行系统进化树分析,结果显示基于不同区段构建的系统进化树中ch-zxy1分别和hpev1bni-788st及hpev5br/53/2006聚类,从而证实了重组事件。基于重组断裂点设计的pcr扩增也进一步验证该重组属于自然发生的重组事件。(3)hpev在镇江地区腹泻儿童群体的流行情况研究为了阐明该hpev毒株是否与镇江地区儿童腹泻疾病的相关性及该地区腹泻儿童群体hpev的流行情况。本研究从镇江地区采集110名腹泻患儿及50名体检对照儿童的粪便标本,以hpev通用兼并引物检测hpev在腹泻儿童群体的携带情况,结果显示腹泻儿童粪便样品hpev阳性15例,总检出率为13.6%,阳性hpev样品的扩增条带经过克隆测序,结果显示其中hpev1为7份占46.6%。50份正常对照粪便标本中,5份hpev阳性标本,检出率10%(5/50);5阳性hpev样品的扩增条带经过克隆测序,结果显示3例hpev1,2例hpev6,与腹泻检出率相比,没有明显的差别。在腹泻儿童粪便样品中还检测到了较少流行的hpev6和hpev7,基于以上研究结果,江苏地区儿童腹泻群体内hpev1为主要的流行型别。结论:(1)本研究运用病毒宏基因组方法成功的地解析了江苏部分地区腹泻肠道内病毒群落的组成(2)本研究从腹泻儿童粪便样品中分离出一株新型hpev毒株并获得其全基因组序列(3)系统进化及重组分析显示该毒株为不同基因型hpev之间重组事件产生的重组体(4)初步阐明hpev在镇江地区腹泻儿童群体的流行状况。