神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是最早发现的神经营养因子（neurotrophin）,对外周及中枢神经元功能特性的表达具有极为重要的调控作用。NGF是由两条118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体,单体分子量为13260.12 Da,含有3对链内二硫键。神经营养性角膜炎（neurotrophic keratitis,NK）是由于三叉神经部分或全部受损导致的退行性角膜疾病,若未进行及时有效的治疗可能造成失明。欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）分别于2017年和2018年批准了大肠杆菌（E.coli）重组的人神经生长因子（rh NGF）上市,其商品名为Cenegermin,是h NGF的首次临床应用。Cenegermin对中度至重度NK患者疗效确切,但其作为孤儿药价格昂贵,严重影响患者的用药可及性。本研究旨在采用大肠杆菌（E.coli）以包涵体形式表达rh NGF,研究小试制备工艺,为后续仿制药的开发打下基础。本文首先对两种融合表达方式制备NGF的工艺路线进行了比较研究。分别设计并构建了含有TEV蛋白酶酶切位点的E.coli BL21（DE3）/p ET28a-（His）₆-pro-TEV-NGF（编号为DMR486）,以及含有胰蛋白酶酶切位点的E.coli BL21（DE3）/p ET28a-pro-R-NGF（编号为DMR635）2种基因工程菌。对这两种工程菌进行发酵和诱导包涵体表达,收集包涵体并经变性和复性后,分别使用相应的工具酶切除标签,电泳分析结果显示复性后的pro-R-NGF蛋白经胰蛋白酶酶切后可产生分子量约为13.3 k Da的条带,表明DMR635的路线基本可行。其次,对DMR635菌株高密度发酵及目的蛋白诱导表达的条件进行了详细优化。通过测定种子液生长曲线,确定了最适的种子液种龄为8h。通过摇瓶发酵筛选到最优发酵培养基与最适摇瓶发酵条件,相比初始发酵条件,重组菌在优化后的菌体湿重提高1.2倍,包涵体湿重提高1.4倍。在5L发酵罐上进行了优化研究,确定5L发酵罐发酵条件为在菌体密度OD₆₀₀为60～80时加入终浓度为0.20 mmol/L IPTG,诱导后控制溶氧在20～50%,诱导时间控制在12～16h。最后,探究包涵体的变性条件、复性方法以及酶切反应中酶与底物的比例（v/v）和反应时间。确定最佳变性条件为:4.0 mol/L盐酸胍、100.0 mmol/L Tris-HCl、10.0 mmol/L EDTA、20.0 mmol/L DTT、p H9.5,包涵体浓度为50.0 mg/m L。复性方法选用脉冲复性,反应时间为5h。以底物完全消失且目的产物不再增加为酶切终点确定酶与底物的最佳比例（v/v）为1:200以及反应时长为4h。总之,本文打通了一条以大肠杆菌为宿主菌、以包涵体融合表达方式,经过变性、复性和酶切步骤制备rh NGF的工艺路线,为Cenegermin生物类似药的开发奠定了基础。