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前言失眠是常见的一种睡眠障碍性疾病,是多种躯体、精神和行为疾病所具有的常见临床表现。流行病学调查资料表明,西方国家约35.2%的人有不同程度的失眠;我国失眠率也高达10%~20%。睡眠障碍可能对人体健康造成严重的危害,长期失眠,不仅导致抑郁,还会造成机体疲劳,导致认知功能障碍,甚至破坏免疫系统功能,对心脏造成损伤,干扰血糖调节、激素分泌等,甚至发展为精神抑郁。失眠的发病原因与遗传因素、生活习惯、环境、疾病和精神心理因素有关。对其发病机制的研究表明,失眠患者5-HT、NE、GABA等中枢神经递质紊乱,边缘-皮质系统环路异常。阿魏酸钠是心脑血管病的常用药物,国外研究和临床观察发现阿魏酸钠具有镇静催眠的作用,然而,阿魏酸钠对中枢神经递质5-HT、NE、GABA以及海马神经细胞有何影响,尚不清楚。目的本研究通过建立失眠大鼠模型,探讨阿魏酸钠对失眠大鼠的睡眠改善作用以及作用机制。材料与方法1.利用对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射制备失眠大鼠模型,观察阿魏酸钠对模型大鼠一般状态、体重变化、戊巴比妥钠致大鼠睡眠时间的影响,并对大鼠GABA、5-HT、NE、IL-1β含量及GABAARa1 m RNA表达量进行测定,同时观察大鼠脑组织病理学变化;2.阿魏酸钠改善睡眠作用与5-羟色胺能神经系统相关性的实验研究。观察阿魏酸钠对大鼠前额叶皮质区、下丘脑部位和海马组织5-HT水平的影响;观察阿魏酸钠分别联合5-HT合成的前体物质5-HTP和5-HT合成酶的抑制剂PCPA后对大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响;Elisa法测定阿魏酸钠对大鼠中枢不同脑区5-HT合成的限速酶色氨酸羟化酶(TPH)和代谢产物5-HIAA的含量的影响;应用RT-PCR技术考察阿魏酸钠对大鼠下丘脑5-HT转运体编码基因Slc6a4和5-HT1A受体编码基因5-HTR1A表达的影响;3.阿魏酸钠对模型大鼠GABA水平影响的机制研究。利用对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射制备失眠大鼠模型,分离各组大鼠脑干、下丘脑、额叶皮质和海马组织,Elisa法测定大鼠脑干、下丘脑、额叶皮质和海马组织GABA水平,HPLC法测定Glu水平,Western Blot法测定GAD、GS水平;4.阿魏酸钠对大鼠海马神经细胞的影响及作用机制研究。叠氮钠诱导大鼠海马神经细胞制备线粒体损伤海马神经细胞模型,MTT法考察阿魏酸钠对线粒体损伤海马神经细胞的保护作用。采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)法制备睡眠剥夺大鼠模型,TUNEL染色法观察阿魏酸钠对大鼠海马神经细胞凋亡的影响,采用透射电子显微镜观察阿魏酸钠对线粒体结构影响,测定阿魏酸钠对线粒体ATP酶活力的影响,RT-PCR法检测各组大鼠海马组织Bcl-2和Bax的m RNA和蛋白表达水平,探讨阿魏酸钠对海马神经细胞的作用机制。结果1.阿魏酸钠对PCPA失眠模型大鼠一般状态,睡眠质量及睡眠相关的神经递质均有较好的调节作用。阿魏酸钠可有效改善模型大鼠的一般状态,缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间、提高GABA、5-HT、IL-1β水平及GABA m RNA相对表达量,同时可有效降低NE水平;2.阿魏酸钠改善睡眠作用与5-羟色胺能神经系统相关性的实验研究。阿魏酸钠可明显提高大鼠前额叶皮质区、下丘脑部位和海马组织5-HT和TPH浓度(P<0.05)。阿魏酸钠组与5-HTP联合应用试验中,阿魏酸钠组以及5-HTP组大鼠睡眠潜伏期均有缩短的趋势,在睡眠持续时间上均有延长的趋势,但差异与空白对照组均无统计学意义(P>0.05),当阿魏酸钠和5-HTP联合应用时,大鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间与空白组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。阿魏酸钠和PACA联合应用试验中,阿魏酸钠组大鼠睡眠潜伏期明显缩短(P<0.05),PCPA组潜伏期明显长于阿魏酸钠组和空白对照组(P<0.05),睡眠持续时间实验结果表明,与空白组比较,阿魏酸钠组可以显著延长大鼠睡眠时间(P<0.05),PCPA组睡眠持续时间明显缩短(P<0.05),联合组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。阿魏酸钠组大鼠海马区、下丘脑部位以及前额叶皮质区5-HIAA的浓度较空白组均显著升高(P<0.05),海马组织与下丘脑5-HIAA/5-HT比值与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。前额叶皮质区5-HIAA/5-HT比值与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。阿魏酸钠组大鼠下丘脑部位Slc6a4表达明显降低,5-HTR1A表达显著升高;3.与对照组比较,模型组大鼠不同脑区GABA、GAD水平均显著降低,Glu、GS水平均显著升高,阿魏酸钠各剂量组均可提高模型大鼠不同脑区GABA、GAD水平,降低不同脑区Glu水平,降低下丘脑、额叶皮质和海马组织GS水平,对大鼠脑干GS调节效果不明显;4.MTT法考察阿魏酸钠对线粒体损伤海马神经细胞的保护作用研究结果显示,线粒体损伤大鼠海马神经细胞存活率较正常对照组显著下降(P<0.05),阿魏酸钠组海马神经细胞存活率高于模型组(P<0.05)。TUNEL染色法结果显示阿魏酸钠可降低睡眠剥夺模型大鼠海马神经细胞凋亡率,RT-PCR结果显示阿魏酸钠可以促进Bcl-2 m RNA和蛋白表达,抑制Bax m RNA和蛋白表达,抑制海马神经细胞凋亡。结论1.阿魏酸钠对PCPA失眠模型大鼠一般状态,睡眠质量均有较好的调节作用;该作用可能是通过增加GABA水平,抑制神经元兴奋,提高5-HT,减低NE水平,降低NE水平来抑制NE的维持觉醒功能来实现。2.阿魏酸钠可通过协同5-HT前体物质5-HTP、拮抗脑内5-HT合成酶抑制剂PCPA、提高5-HT能神经系统的兴奋性、抑制5-HT转运体表达、增强5-HT受体表达等机制发挥改善睡眠的作用;3.阿魏酸钠对大鼠GABA水平影响可能是通过影响脑组织各部位中GAD及GS的表达水平,抑制或促进GABA与Glu之间的相互转化,改变Glu/GABA比值平衡实现的;4.阿魏酸钠可以抑制睡眠剥夺引起的海马神经细胞凋亡,从而改善睡眠,其作用机制与促进Bcl-2 m RNA和蛋白表达,抑制Bax m RNA和蛋白表达有关。