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褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是危害水稻的主要害虫之一,在亚洲稻区频繁爆发。除了直接刺吸植物茎秆汲取营养、产卵为害外,褐飞虱导致的水稻病毒传播更造成了进一步为害。长期以来,很多种类的杀虫剂被用于防治褐飞虱,包括有机磷类、氨基甲酸酯类、苯吡唑类、噻嗪酮、吡蚜酮和新烟碱类杀虫剂。然而,褐飞虱对众多杀虫剂产生了一定水平抗性,使得化学防治效果受到严重威胁。醚菊酯是一种非酯键的拟除虫菊酯类杀虫剂,其以醚键代替传统拟除虫菊酯类杀虫剂的酯键,对鱼类和蜂类低毒,并且对稻飞虱防治效果良好,醚菊酯在多个国家和地区被用于防治水稻害虫,比如日本、越南、韩国和中国台湾地区。近年来,为了增加杀虫剂多样性,醚菊酯在我国被登记用于防治水稻害虫,为了制定合理的抗性治理策略,需要对抗药性机制开展深入研究。害虫对拟除虫菊酯杀虫剂抗性机制主要分为解毒代谢作用增强、靶标敏感性下降、表皮渗透速率降低和行为学改变等。多功能细胞色素P450单加氧酶是参与昆虫内源和外源化合物代谢的超基因家族,可代谢包含有机磷、新烟碱和拟除虫菊酯类杀虫剂在内的多种农药。通常情况,P450基因的过表达是导致P450介导的昆虫抗药性的主要原因,随着褐飞虱全基因组测序和注释的完成,54个P450基因被鉴定,为我们全面分析每一个P450基因在褐飞虱对醚菊酯抗性中的代谢作用提供了全面信息。另外电压门控钠离子通道几乎在所有可兴奋神经细胞的动作电位产生与传导中都起着不可或缺的作用,是拟除虫菊酯杀虫剂的主要作用靶标,如果需要阐明可能的靶标不敏感性机制,需要对褐飞虱钠离子通道基因和可能的选择性剪接本进行分析,以鉴定可能的抗性突变位点。一、褐飞虱对醚菊酯代谢抗性分子机制为了研究褐飞虱对醚菊酯抗性的分子机制,我们用醚菊酯对褐飞虱室内种群连续筛选16代,并得到了褐飞虱对醚菊酯抗性种群G16,该种群抗性倍数达到422.3倍。增效剂研究发现,代谢抑制剂PBO对抗性种群的抗性增效倍数显著升高至2.68倍,这表明褐飞虱细胞色素P450单加氧酶在其代谢抗性中起关键作用。与相同虫源但不经过药剂筛选的敏感品系（US16）相比,抗性种群G16中有11个P450基因显著上调,其中8个基因上调倍数超过2倍,4个基因（CYP3 Clade的CYP6AY1、CYP6FU1、CYP408A1 和 CYP4 Clade 的 CYP425A1）上调超过 4 倍。对这些 P450基因进行RNA干扰实验发现,当CYP6FU1、CYP425A1和CYP6AY1分别被干扰后,G16种群的敏感性显著恢复;但对CYP408A1和CYP353D1的干扰并不显著影响种群对醚菊酯的敏感性。综合P450基因表达量分析和RNA干扰实验结果,CYP6FU1不仅在抗性种群中表达量上调最高,且被干扰后对种群抗性倍数影响最大,结果表明CYP6FU1是导致褐飞虱对醚菊酯代谢抗性的最重要P450成员之一。二、褐飞虱电压门控钠离子通道基因克隆及其功能和药理学特性研究为了进一步研究褐飞虱对醚菊酯靶标抗性机制,我们克隆了褐飞虱钠离子通道并体外表达以研究其药理学特性。通过对41条褐飞虱钠离子通道NlNav全长克隆测序,鉴定到了 9个可变性剪接外显子,其中6个已经在其他昆虫钠离子通道中被报道过,另外3个是褐飞虱钠通道中特有的选择性外显子。由于可变性剪接,这41条褐飞虱钠离子通道中存在24种不同的转录本。同时,测序鉴定到了 29个RNA编辑位点,但导致氨基酸变化的RNA编辑位点仅有3个。因此,推测可变性剪接是褐飞虱钠离子通道功能多样性的主要原因。在非洲爪蟾卵母细胞中体外表达不同的转录本,发现11条钠通道转录本能够产生足够大的电流。然后,用双电极电压钳测定了11条可功能性表达的褐飞虱电压门控钠离子通道转录本的电压门控特性及其对3种拟除虫菊酯杀虫剂的药理学特性,结果表明这11条转录本不仅激活和快失活脉冲电压V1/2值变化范围很大,慢失活的脉冲电压V1/2值和对不同拟除虫菊酯杀虫剂敏感性也存在显著差异。对褐飞虱电压门控钠离子通道多个转录本的序列特点、门控特性和药理学特性分析,为进一步研究褐飞虱钠通道的生物功能和分子抗性机制提供了有利基础。三、基于褐飞虱电压门控钠离子通道突变的醚菊酯靶标抗性机制研究在过去的几十年中,许多研究鉴定到大量的电压门控钠离子通道上的突变与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关。在用醚菊酯连续筛选16代得到的褐飞虱抗性种群中,我们鉴定到了 3个高频出现的突变位点,其中包含在许多昆虫拟除虫菊酯杀虫剂抗性种群中均发现的kdr突变L2i16F和super-kdr突变M2k11T,还鉴定到另一个位于钠离子通道第I跨膜区域第5跨膜片段的突变T1o13A。T1o13A位点是目前仅在褐飞虱对菊酯类杀虫剂抗性种群中鉴定到的新突变位点。为了研究这些突变位点对褐飞虱钠离子通道敏感性的影响,通过定点突变和卵母细胞体外表达,检测并分析了敏感型通道NINav1-1和7个突变体对3种拟除虫菊酯杀虫剂敏感性差异。结果表明,3个突变位点均能显著降低敏感通道对拟除虫菊酯杀虫剂敏感性,且T1o13A和M2k11T单突变都会造成通道电压依赖激活电压V1/2和快失活电压V1/2向去极化方向移动。我们曾预测过一个双药剂结合位点的钠离子通道模型（PyR1和PyR2）,PyR1由IIL45、IIS5和IIIS6中的残基组成,而PyR2由IL45、IS5和IIS6的残基组成。M2k11T突变位于PyRl上,而L2i16F突变位于PyR2上。值得一提的是,T1o13A突变是目前有报道的第二个位于PyR2的kdr突变,进一步验证了昆虫电压钠离子通道双药剂结合位点假说。四、外显子b对褐飞虱电压门控钠离子通道体外表达水平影响分析哺乳动物有超过9个编码钠离子通道的基因,而昆虫通常只有一个编码钠离子通道的功能基因。但是,昆虫丰富的可变性剪接和RNA编辑等转录后调控可以产生多种功能和药理学特性各异的钠离子通道转录本。我们通过体外克隆得到的24条可变性剪接转录本中,除了 NlNav16和NlNav24可能因部分跨膜区缺失而不能在非洲爪蟾卵母细胞中功能性表达以外,其余22条NlNav转录本在表达后均能用双电极电压钳检测到可见的钠电流。但是,相对于11条含有外显子b的NlNav转录本,11条不含外显子b的NlNav转录本可以在更短的时间内表达更大的钠电流。在先前的研究中,如果将外显子b从德国小蠊含有外显子b的钠离子通道中敲除后,体外表达得到的电流较敲除前显著增大。说明外显子b对昆虫钠离子通道体外表达水平有负面影响。通过基因组序列比对,我们发现在超过20种昆虫和蜘蛛中,外显子b序列高度保守,且都是3’端受体剪切类型。我们选择3个褐飞虱钠离子通道外显子b中的高度保守氨基酸位点（S772A、Y774A/F/Q和Y775A/F）进行体外突变,后发现突变后通道（Y774A和Y774A/S772A等）表达水平显著恢复。