目的　　 利用成骨细胞与血管内皮祖细胞联合培养构建组织工程骨,观察周期性动态压力促进其成骨能力及微血管生成的研究　　 方法　　 取200克Wistar大鼠,采用密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法分离出骨髓单个核细胞,用条件培养液从原代开始诱导培养,诱导其形成血管内皮祖细胞;取新生Wistar胎鼠,无菌条件下取出颅骨,利用酶消化方法,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行“多次贴壁法”纯化。取第三代血管内皮祖细胞及成骨细胞,分别给予红色荧光及绿色荧光标记,种植在壳聚糖支架,将细胞.支架复合物随机分为A、B、C、D四组,A组为血管内皮祖细胞+成骨细胞+壳聚糖支架,给予1Hz频率,5%形变压力值,B组为血管内皮祖细胞+壳聚糖,给予1Hz频率,5%形变压力值,C组为成骨细胞+壳聚糖给予1Hz频率,5%形变压力值,D组为血管内皮祖细胞+成骨细胞+壳聚糖直接培养,未给予压力刺激。七天后将细胞-支架复合物取出,继续培养直至两周,进行形态学检测,利用共聚焦显微镜观察四组支架上的细胞血管化能力。Real-time PCR检测各组ALP,OC,Flk-1,vWF等相关基因表达。　　 结果　　 1、成功分离、纯化、培养血管内皮祖胞及成骨细胞,细胞贴壁后,原代及传代细胞生长良好,具有典型形态特点。　　 2、成功将两种细胞进行荧光标记:血管内皮祖细胞进行CM-Dil红色荧光标记;成骨细胞进行CFSE荧光标记。两种细胞种植到壳聚糖支架上,构成良好的三维立体培养载体。　　 3、共聚焦显微镜观察三维血管化能力,各组微血管计数A组＞B组＞D组＞C组,P＜0.05　　 4、Real-timePCR结果提示各组之间ALP,OC,Flk-1,vWF基因的相对表达均存在差异,P＜0.05。单纯压力培养组的基因表达水平大于单纯联合培养组,而两者共同作用效果具有协同作用,大于两者简单加和的结果。　　 结论　　 周期性动态压力以及细胞联合培养可以作为单一因素对血管内皮祖细胞的血管化能力、以及成骨细胞的成骨能力具有促进作用,同时两者共同作用具有协同效应,显著上调相关特异基因的表达。