禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)是一类通过水平传播或垂直传播，造成禽产生多种良性或恶性的肿瘤的反转录病毒，其感染产生的肿瘤主要有淋巴细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤、血管瘤、禽肉瘤、内皮瘤、纤维肉瘤以及真性红细胞增多症等。根据病毒囊膜糖蛋白抗原差异、病毒干扰实验以及宿主范围，从鸡体中分离的ALV可以分为6个亚群(A-E，J)。ALV-J是在1989年被分离鉴定出的禽白血病病毒亚群，主要引起肉用型鸡发生髓细胞瘤。近年来尽管禽白血病在世界大部分国家都得到了有效的控制，然而该病在中国却越来越严重，给养禽业造成了巨大的损失。目前由ALV-J引起的禽白血病在中国呈地方性流行，该病毒造成蛋鸡产蛋迅速下降，并能导致蛋鸡和一些地方品种鸡形成血管瘤。为了探究ALV-J的致病机理以及病毒与宿主的相互作用，我们运用二维电泳结合质谱分析的差异蛋白质组学方法对DF-1细胞感染ALV-J前后的蛋白表达变化进行研究，以寻找致病和致肿瘤相关的差异表达蛋白。　　 1.DF-1细胞二维电泳方法的建立　　 二维电泳是蛋白质组学研究的核心技术之一，为了研究DF-1细胞在感染病毒后的蛋白质组学变化，首先需要建立和优化DF-1细胞二维电泳方法。在本实验中我们使用17cm固相pH梯度胶条进行等电聚焦，对5种细胞裂解液的配方进行了优化，同时还对蛋白在不同的等电聚焦条件、不同的水化条件、不同的蛋白上样量、不同SDS-PAGE凝胶浓度条件下的二维电泳图谱进行比较，并用PDQuest软件分析优化选择。最终确定裂解液成分为7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS，40mMDTT，0.2％Bio-Lyte3-10,1mM Protease Inhibitor Cocktail;蛋白上样量为300μg，以主动水化的方式溶胀进入胶条;等电聚焦过程采用4，5000VH，二向凝胶浓度确定为12％。从而成功建立了DF-1细胞的二维电泳方法，获得分辨率和重复性均可满足分析要求的DF-1细胞的二维电泳图谱，为后期研究病毒感染细胞的差异蛋白质组学提供技术支持。　　 2.J亚群禽白血病病毒感染DF-1细胞的蛋白质组学研究　　 运用二维电泳结合质谱分析的蛋白质组学方法对DF-1细胞在感染ALV-J后不同时间点的细胞总蛋白的差异变化情况进行研究。结果发现感染后6h、12h、1d、2d、3d、5d和7d的7个阶段共有86个差异蛋白，差异表达蛋白主要集中在感染后6-12h。质谱分析共成功鉴定出74个差异蛋白，其中30个上调，44个下调。这些差异表达蛋白从分子生物学过程来分析主要参与新陈代谢过程、大分子代谢过程、生物学调控过程、应激反应、生物合成等过程;按蛋白功能来分主要具有水解酶活性以及蛋白结合、氧化还原、核酸结合等功能。通过蛋白相互作用网络图，我们发现DJ-1、UCHL1、PEBP1、NPM1、HMGB1、ANP32A、TRAP1和VDAC1等蛋白与细胞凋亡及肿瘤的形成、发展联系紧密。其中DJ-1最初是作为肿瘤基因被发现的。它在细胞的转变、蛋白-RNA相互作用的控制、氧化应激反应以及男性生育等过程中起重要作用;UCHL1是去泛素化酶家族重要成员之一，在细胞增殖、细胞周期、凋亡和信号转导多种生物学过程中起重要作用;PEBP1是一种磷脂结合蛋白，又称Raf激酶抑制蛋白。激活的Raf蛋白与细胞生长、细胞周期停滞甚至与凋亡有关;NPM1是核仁磷酸蛋白穿梭于细胞核与细胞浆之间，参与核糖体的装配和转运。NPM能对DNA的损伤进行调控，可以激活NF-κB转导因子，阻止细胞发生凋亡;HMGB1是典型的非组蛋白，属于HMG高迁移率族蛋白。HMGB1释放于细胞外可参与炎性反应、细胞增殖、分化、迁移及神经生长等过程，并与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合，参与肿瘤的发生、生长、浸润和转移。这些信息为进一步研究ALV-J的致病、致肿瘤机理提供了有用的蛋白质相关基础依据。　　 3.DJ-1、UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1基因real-timePCR标准品的制备及各基因在ALV-J感染中变化情况　　 为了检测DJ-1、UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1基因在ALV-J感染过程中的变化，我们利用PCR的方法扩增出各基因片段，然后连接pGEM-T载体，构建各基因的载体质粒作为标准品。将鉴定正确的各基因的T载体质粒进行10倍梯度稀释，用real-time PCR扩增各基因分别建立标准曲线。然后以ALV-J感染后的DF-1细胞为模板进行real-timePCR扩增。结果发现所有检测基因在ALV-J感染后5d和7d均发生下调，而在感染后6h和12h，除了TRAP1下调外其它检测基因均上调。DJ-1在感染初期上调后，一直处于下调状态。UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1在感染后1-3d并没有明显的变化规律。TRAP1在感染后6h和2d下调超过10倍，而在感染后1d上调超过10倍。这些基因转录水平变化规律一方面部分验证了在二维电泳中各差异蛋白的变化，另一方面丰富了蛋白质组学的研究内容，也为进一步研究这些蛋白的功能提供了借鉴。　　 4.鸡源DJ-1蛋白的原核表达及多抗血清的制备　　 DJ-1与癌症的发生和发展紧密相关，在一些肿瘤组织或细胞内，DJ-1的表达显著高于相邻的外周组织或正常细胞。在禽白血病病毒J亚群(ALV-J)的早期感染的蛋白质组研究中发现了DJ-1蛋白的上调。为了进一步研究DJ-1蛋白在ALV-J感染中的生物学作用，从DF-1细胞的cDNA中扩增DJ-1基因编码区，连接T载体后克隆入pET-32a载体进行原核表达，之后对表达的蛋白进行纯化并免疫BALB/c小鼠制备多抗血清。实验结果表明:IPTG终浓度为0.4mM，37℃诱导3h后，DJ-1蛋白在重组细菌以可溶性形式大量表达;小鼠血清抗体ELISA效价达到20480以上。利用抗His标签的单抗以及小鼠多抗血清作为一抗的Western blot结果均显示在40.3kD处有特异性条带，说明DJ-1蛋白得到了正确表达并能与特异性的抗体反应具有良好的反应原性。DJ-1蛋白的原核表达及多抗血清的获得为今后研究该蛋白在ALV-J致病性中的功能提供实验材料。