论文部分内容阅读
目的： 角膜神经损害是引起糖尿病角膜病变的高危因素之一，充分阐明糖尿病角膜神经损害的发病机制，为全面研究糖尿病周围神经病变的发病机制提供了全新的观点。在本研究中我们通过微小RNA（miRNA）直接作用于靶向基因Atg4B，从而对糖尿病角膜神经损害的保护作用及其分子机制进行研究。 方法： 本研究选用链尿佐菌素（STZ）诱导I型糖尿病C57小鼠作为动物模型。首先探讨miR-34c及自噬强度在小鼠三叉神经节（trigeminal ganglion, TG）组织中的表达。通过生物信息学软件预测分析 miR-34c 作用的靶基因，筛选 Atg4B 为miR-34c的目标基因，运用荧光素酶报告基因检测技术进行验证，并在体外培养的 TG 神经细胞上再次进行验证。体外原代培养小鼠 TG 三叉神经节细胞，研究miR-34c antagomir对TG细胞轴突生长及存活情况的影响。建立I型糖尿病小鼠角膜上皮损伤的动物模型，给药方式为结膜下注射。实验分组：正常组、糖尿病组、糖尿病+miR-34c antagomir 组、糖尿病+miR-34c antagomir NTC组。检测抑制miR-34c表达对糖尿病小鼠角膜上皮愈合速率的影响；观察抑制miR-34c的表达对糖尿病角膜上皮损伤后神经纤维的修复作用；Western Blot 及免疫荧光实验检测自噬相关蛋白Atg4B、LC3-II的表达。 结果： 与正常的C57小鼠相比，链尿佐菌素（STZ）诱导I型糖尿病C57小鼠表现为多饮、多食、多尿、持续高血糖等糖尿病基本特征。通过real-time PCR技术发现 miR-34c 在 I 型糖尿病小鼠三叉神经中表达明显增加（P<0.05）。通过western-blot 及免疫荧光共定位技术检测显示，与正常对照组相比，自噬相关蛋白Atg4B、LC3-Ⅱ在I型糖尿病小鼠三叉神经中表达显著下调（P<0.05）。 荧光素酶报告基因检测技术显示：miR-34c对Atg4B的报告荧光有明显的下调作用，当靶位点突变后，报告荧光有所恢复，证明miR-34c确实通过与Atg4B 3’UTR 结合直接调控 Atg4B 的表达，Atg4B 是 miR-34c 的靶基因。同时采用western-blot进行了蛋白水平验证。 应用miR-34c antagomir处理原代培养的三叉神经节细胞，结果显示，与正常培养三叉神经节细胞相比，miR-34c antagomir处理后三叉神经节细胞突触长度显著增加（P<0.05）。 刮除小鼠角膜上皮后，糖尿病组角膜上皮愈合速率较正常组相比明显减慢（P<0.05）,抑制miR-34c的表达，糖尿病+miR-34c antagomir组的角膜上皮愈合速率比糖尿病组明显加快（P<0.05）；小鼠角膜上皮刮除后，糖尿病小鼠结膜下注射miR-34c抑制剂14天后(2.5 nmol 抑制剂或对照/眼)，miR-34c处理组角膜中央及周边的基底神经丛的密度均高于糖尿病组（P<0.05）；抑制miR-34c的表达，细胞自噬水平增强，与糖尿病小鼠相比，糖尿病+miR-34c antagomir组小鼠的TG组织中Atg4B、LC3-II的表达明显增强（P<0.05）。 结论： 1. I型糖尿病小鼠三叉神经节组织中miR-34c表达上调，自噬减弱。 2. Atg4B是miR-34c的靶基因。 3. 细胞自噬参与糖尿病小鼠角膜上皮损伤后的修复过程。 4. 抑制 miR-34c 的表达可以直接通过靶向 Atg4B，激活自噬，促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤愈合和三叉神经节神经元及糖尿病角膜神经病变的神经再生。