研究背景苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种由苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)或四氢叶酸(BH4)缺陷所导致的常染色体隐性遗传疾病,根据患者血中苯丙氨酸的浓度是否大于1200umol/L分为经典型和非经典型,其中经典型PKU患者占该疾病患者总数的90%,经典型PKU主要的临床表现为高苯丙氨酸血症,在新生儿阶段如果不经过有效的苯丙氨酸限制性干预治疗则发展为认知和行为障碍等神经系统病变,对患者的危害十分严重,据统计,苯丙酮尿症在我国的发病率为1:11144,患有苯丙酮尿症的新生儿需要立即接受低苯丙氨酸的饮食治疗,并且该治疗至少需要持续到成年阶段,昂贵的治疗费用对患者家庭是一个沉重的负担。根据该统计数据,就河南一省每年约有200例PKU患儿出生,该疾病的为按照患者每年平均2万元的治疗费用计算,仅的治疗费用一项每年就需要4000万元,此外还会引发相关的社会问题,该疾病不但严重影响患者的身体健康和生活质量,还具有巨大的社会危害性。因此本研究主要对经典型苯丙酮尿症患者体内PAH基因的突变进行相关的检测和分析。PAH基因定位于人体12号染色体,如果夫妇双方均为突变型基因携带者,胎儿则有四分之一的几率患有该疾病,迄今为止数据库收录的PAH基因突变已经超过了 500种,其中大部分为点突变和缺失突变。PAH基因的突变在其基因的各个位置分布不均,多种热点突变集中出现在相邻的几个外显子中。而苯丙酮尿症的发病主要由苯丙氨酸羟化酶基因发生突变进而使酶的结构异常所导致,该酶基因结构上的复杂决性定了其突变位点的多样性,传统上对于苯丙酮尿症致病基因PAH的检测方法主要有:PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)、PCR-单链构态多相性(PCR-Single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)、高分辨熔解曲线(High resolution melting,HRM)、高效液相色谱分析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)等,但是随着基因组学,基因测序技术的飞速发展,尤其是大规模并行测序的普及使基因测序成为检测苯丙酮尿症及相关遗传疾病基因突变的首选方法。基于此需要建立一组与地域、种群等相关的具有诊断价值的突变位点数据库,尽管目前可以通过液相杂交捕获的方法获取突变基因上成千上万的突变位点,但捕捉芯片价格昂贵,不适合广泛的临床应用。因此分析PAH基因突变的情况并加以归纳总结就显得尤为重要。基于此本研究分为三个部分:第一部分经过文献检索收集和数据归纳整理,探讨全国17个省PAH基因突变的特点;第二部分分析河南省PKU患者PAH基因的突变情况;第三部分通过第二代基因测序技术检测对PKU患者进行基因诊断探讨其技术的优越性。第一部分全国17省市PAH基因突变情况的调查分析目的为丰富我国苯丙氨酸羟化酶基因突变数据库,探讨全国17个地区、不同民族之间苯丙氨酸羟化酶基因突变的特点并加以比较。方法1.文献检索按照检索式:(苯丙酮尿症or苯丙氨酸羟化酶基因突变)and突变频率and(外显子or剪接区)检索相关文献2.文献甄别筛选检索到的文献按照纳入排除的标准文献的甄别筛选纳入标准:(1)研究内容为报道PAH基因突变;(2)研究例数在10例以上,收集患者或其家系的标本进行PAH基因突变的相关论著性文献;(3)研究方法为常用的基因位点突变研究方法(4)原始文献有足够的信息表达量排除标准:(1)研究对象分组不明确(2)数据资料不完整(3)个案报道类、综述类文献。3.数据分析采用SPSS19.0软件包进行分析,计数数据采用X2检验,以α=0.05为检验水准。结果1全国各地区苯丙酮尿症基因突变的研究状况37篇全国范围内针对苯丙酮尿症患者PAH基因相关突变位点的研究,文献研究覆盖全国17个省、自治区、直辖市全部研究时间范围为1994年-2017年,包含PAH基因外显子1、2、3、4、5、6、7、10、11、12及其两侧的剪接区位点。研究样本总例数1455例,所有文献共检出突变位点2929个。2全国范围内苯丙酮尿症患者PAH基因突变情况根据已收集到的调查统计结果,PAH基因的热点突变有14个,其中错义突变7个,无义突变4个,剪接突变、沉默突变、缺失突变各1个。热点突变频率在2%以上的突变位点有6个,分别为:R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 其余热点突变分别为:R241C、IVS4-1G>A、S70del、A434D、R53H、W326X、Y166X、R408W。3全国苯丙酮尿症患者PAH基因热点突变分布情况R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 6 个高频热点突变频率在全国北方、南方、西部地区的分布有所差异其中R243Q、V399V和R413P在中国北方、南方、西部地区的突变频率差异有统计学意义。4汉族、回族、维吾尔族苯丙酮尿症患者PAH基因热点突变情况R243Q、Y204C、Y356X、R111X、V399V、R413P 6 个高频热点突变频率在全国汉族、回族和维吾尔族人群中的分布差异显著有统计学意义。结论R243Q是中国人群中PAH基因的最主要突变位点,此外Y204C,Y356X,R111X,V399V,R413P的突变在我国人群中分布广泛,但是具有一定的地域差异性和民族差异性。第二部分 河南省PKU患者PAH基因的突变情况研究目的本研究旨在探索河南省人群经典型PKU患者PAH基因突变的情况,为该地区民族建立PAH基因突变数据库,为其遗传咨询,产前诊断提供重要的参考数据。方法本研究根据人民卫生出版社出版的第八版《医学遗传病学》诊断标准以2015年1月-2016年1月来自郑州大学第三附属医院遗传咨询门诊、郑州大学第三附属医院河南省新生儿筛查中心进行基因诊断的25例苯丙酮尿症家系为研究对象1.应用人外周血基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA的提取。2.应用用PCR方法通过引物对的PAH基因13对外显子引物进行突变位点的捕获和扩增。3.应用Sanger测序法对捕获的PAH基因13对外显子DNA进行测序4.统计方法见第一部分。结果1河南省PKU患者的新型突变检测到发生在第3外显子上的c.251A>G的新型基因突变。2苯丙酮尿症患儿PAH基因突变位点的检出情况在50条染色体中共检测到28种,53个基因突变,突变检出率为92%。25例患儿中有2例未检测到突变位点,7例患儿检测到3个位点突变,11例患儿检测到2个位点突变,5例患儿检测到1个位点突变。3苯丙酮尿症患儿PAH基因突变位点的突变频率的分布情况53个突变位点分布于PAH基因第3、6、7、11、12、13外显子以及第4、5、6、12内含子区域(见表8);发生突变频率最高的区域是第6、7外显子区域,占总体突变的53.7%,其中突变频率最高的位点为c.1238G>C(p.R413P),突变频率为 17.0%、其次为 c.617A>G(p.Y206C)和 c.728G>A(p.R243Q)分别占总突变频率的7.5%。结论1.本研究首次发现PKU患者PAH基因第3外显子上251位点碱基A>G的突变,即c.251A>G(p.D84G)的新型突变;2.以下三种突变 c.1238G>C(p.R413P)、c.617A>G(p.Y206C)和c.728G>A(p.R243Q)是本省PKU患者PAH基因突变的热点突变第三部分 利用第二代基因测序检测苯丙酮尿症患者PAH基因突变目的本研究拟利用第二代基因测序技术对苯丙酮尿症患者做出基因诊断,将二代测序在检测苯丙酮尿症患者PAH基因突变位点的准确性同一代测序进行对比,为建立该疾病的第二代基因测序技术诊断平台的建立提供数据支持。方法本研究根据人民卫生出版社出版的第八版《遗传病学》诊断标准对象为2014年1月至2016年1月到郑州大学第三附属医院妇产科就诊的25个计划接受基因诊断的苯丙酮尿症患者为研究对象。1.应用人外周血基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA的提取。2.应用用多重PCR方法通过设计的PCR长引物对PAH基因进行全外显子捕获和扩增。3.应用第二代基因测序平台对捕获的PAH基因13对外显子DNA进行测序4.统计分析方法同第一部分结果1测序文库的构建情况长引物PCR捕获方法的文库构建成功、文库片段基本分布在200bp左右达到序列分析标准2第二代基因测序技术对PKU患者PAH基因突变的检出情况通过第二代基因测序对确诊的25例苯丙酮尿症患儿检测中,对其PAH基因13个外显子和其双侧剪接区进行测序分析结果显示在50条染色体中共检测到29种,54个基因突变,25例患儿中有1例未检测到突变位点,突变检出率达到了 96%。被检出样本中7例检测到3个位点突变,11例检测到2个位点突变,5例检测到1个位点突变。同一代测序进行结果准确性对比差异无统计学意义。结论第二代基因测序技术同一代测序技术相比在分析苯丙酮尿症患者PAH基因突变方法测序速度更快,结果可靠,成本低廉、适合进行大样本量大范围的突变位点的测序检测。