草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)隶属水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒，目前己经报道了10多个分离株。该病毒引起我国淡水养殖主要品种草鱼(Ctenopharyngodon idellus)在鱼种甚至成鱼阶段发生出血病，死亡率可高达60％以上，给我国的水产养殖造成巨大损失。自20世纪50年代以来，我国鱼病科研工作者就致力于草鱼出血病的防治研究，免疫防治取得了较好的效果。但是，在疫苗应用的过程中也发现，同一地区的草鱼出血病疫苗对本地区有效，免疫其他地区则可能效果欠佳甚至完全无效，推测不同地区的草鱼呼肠孤病毒流行株存在较大差异。要想有效的防治草鱼出血病，必须开展草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学调查，弄清不同地区草鱼呼肠孤病毒的流行病学本底。　　 本实验室在开展草鱼呼肠孤病毒流行病学调查过程中，从浙江湖州地区的发病草鱼中分离到一株病毒，暂命名为草鱼呼肠孤病毒HZ08株(GCRV HZ08)。取感染的草鱼肾脏细胞(CIK)做超薄切片在电镜下观察，发现细胞质内有大量呈晶格状排列的病毒粒子，无囊膜，近球形，直径约70nm，形态与已报道的GCRV相似。病毒粒子在CIK细胞内的分布方式与以前报道相同。将病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化，证实为双链RNA（dsRNA）病毒。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示，病毒基因组按分子量大小分为大、中、小三组，共有11个dsRNA组成，呈现典型水生呼肠孤病毒基因组特征。鱼体感染实验表明，HZ08株对草鱼鱼种(10cm)的致死率在75％左右。　　 为了从分子水平上检测病毒，我们根据GenBank中已发表的GCRV873株和其他呼肠孤病毒的序列设计了18对引物，对HZ08株的基因组进行扩增，均没有得到预期的目的片段，说明HZ08株与GCRV873株和其他已发表部分序列的呼肠孤病毒的基因组序列差异较大，而根据文献中GCRV861株S6的引物(861-S6)能检测到HZ08株，说明HZ08株在基因组序列方面与861株可能有一定的相似性，但目前尚未见863株基因组序列的报道，因此无法从基因序列上进行比较。在筛选引物对HZ08株及其他几株草鱼呼肠孤病毒进行检测的过程中，我们发现采用文献中根据水生呼肠孤病毒S6节段保守区设计的简并引物可以检测以873株为代表的一组草鱼呼肠孤病毒，采用861-S6引物能够检测与873株基因组序列差异较大的一些草鱼呼肠孤病毒分离株。在现阶段对草鱼呼肠孤病毒流行株本底还不清楚的情况下，这两对引物无疑对毒株的分离鉴定具有重要意义。　　 为了从分子上进一步确认病毒种类，弄清楚该分离株的分子遗传特征,确定HZ08株的分类学地位及与其他呼肠孤病毒的种系发生关系，我们在借鉴前人研究的基础上，通过对各个技术环节不同处理的对比，对克隆的上游技术和克隆方法做了重要改进，建立了特异性强、省时省力、可重复性强的实验操作方案，成功克隆了HZ08株的11个节段的全长，获得了病毒的全基因组序列。病毒的全基因组测序结果表明，GCRV HZ08株基因组全长为24.707Kb，其S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11基因组大小分别为3927、3870、3753、2263、2229、2030、1604、1560、1320、1124和1027bp。在GenBank中的登录号分别为S1GQ896334、S2 GQ896335、S3 GU350742、S4 GU350743、S5 GQ896336、S6GQ896337、S7 GU350744、S8 GU350745、 S9 GU350746、S10 GU350747、S11GU350748。　　 通过对基因组各节段的末端序列分析，本研究发现，除S8的3′末端保守序列为UGCAUC3′外，HZ08株各节段拥有共同的末端保守序列5.GUAAUUU......UUCAUC3′。另外，邻近末端保守序列，各个基因节段又拥有节段特异的倒转重复序列。GCRV HZ08株各节段的末端保守序列与GCRV873株极为相似，仅在5′末端的保守序列(GCRV8735GUUAUUU)中相差一个碱基。具有末端保守序列和倒转重复是呼肠孤病毒科病毒株的一个基本特征，在病毒对其基因组进行筛选以及装配过程中可能起到重要作用。　　 通过BLAST预测HZ08株各节段编码的蛋白和水生呼肠孤病毒属，正呼肠孤病毒属成员编码蛋白的关系，使用分子生物学软件对各节段核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析，绘制系统发生进化树，并分析各基因编码产物的功能区与结构域，从而预测各蛋白的功能。　　 HZ08株各基因组节段编码的蛋白功能预测如下：　　 (1)S1节段编码的蛋白VP1与哺乳动物(MRV)λ2蛋白具有相同的功能motif(鸟苷酰转移酶功能区的两个必须赖氨酸在173和195位，附近具有S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的结合位点(LDLGTGPEA/C)，位于第832-838位氨基酸）。预测HZ08株VP1蛋白具有鸟苷转移酶和甲基转移酶活性，是病毒的RNA帽化酶，在病毒复制时mRNA的加帽过程中发挥作用。　　 (2)S2节段编码的蛋白VP2具有RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的功能，具有RdRp特有的三个功能motif(motifⅠ位于592-602氨基酸，motifⅡ(SG)位于688-689氨基酸，motifⅢ(GDD)位于739-741氨基酸）。RdRp在呼肠孤病毒科各属之间是最保守的，氨基酸序列分析也表明，motifⅡ(SG)和motifⅢ(GDD)在呼肠孤病毒中是完全保守的。　　 (3)S3节段编码的VP3蛋白具有锌指结构和N端特征性亲水区，推测与MRVλ1蛋白具有相似的功能，即具有ATPase活性，还能与病毒dsRNA连接。　　 (4)S4节段编码病毒的非结构蛋白，与MRVμNS的同源性约在25％。　　 (5)S5节段编码的蛋白VP4与MRVμ2蛋白的同源性高达25％，发现具有ATPase的两个特征性基序：motifA（TIAMAKGSFKST,400-411），motifB(DDAG,435-438)。据此可以推测HZ08株VP4蛋白可能具有核苷三磷酸酶活性。　　 (6)S6节段编码的蛋白VP5与MRV的μ1蛋白同源性高达24％，在HZ08株VP5蛋白中发现了天冬氨酸和脯氨酸裂解位点，这个裂解位点在所有的正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒中都存在。并且发现HZ08和MRV的亲水曲线十分相似，C末端有4个较大的亲水区，且都位于蛋白的表面，推测能形成环和折叠结构，与VP5蛋白和其他病毒蛋白的相互作用有关。同时还发现这4个区域的抗原性都较高，推测可能引起宿主细胞的免疫反应。此外，VP5蛋白N端的疏水区较多，推测这些疏水区可能与病毒的侵入有关。　　 (7)S7节段编码一个长达512个氨基酸的蛋白质(VP56)，其N端约300多个氨基酸与MRVσ1的同源性为22％。通过motifscan对S7编码的蛋白进行基序分析，发现两个N端糖基化位点(525-528)，由此推测VP56可能是一种糖基化蛋白，其中一个或多个糖基化位点可能与病毒和细胞的吸附有关。　　 (8)S9能够编码一个长达418个氨基酸的蛋白质(VP47)，与MRVσ2蛋白具有较高的同源性，亲水曲线和二级结构也与MRVσ2较为相似，推测VP47与σ2有相似的功能。　　 (9)S10编码的蛋白VP38由345个氨基酸组成，与ARV的σNS具有较高的同源性，是一个糖基化蛋白，推测有与ssRNA连接的活性。　　 (10)S8和S11都包含一个单一的ORF，未搜索到同源性蛋白，预测编码病毒的非结构蛋白。　　 本研究为我国草鱼呼肠孤病毒的研究提供了一个新例，根据其各基因节段与水生呼肠孤病毒、正呼肠孤病毒的同源性和系统进化分析，推测该毒株可能是在自然感染过程中经长期重配形成的，对研究草鱼呼肠孤病毒的遗传进化具有重要的意义。本研究丰富了草鱼呼肠孤病毒的基因组信息，对开展草鱼呼肠孤病毒的流行病学调查，有效防治草鱼出血病也具有重要的意义。