一、柑橘褐斑病菌比较基因组和转录组分析柑橘褐斑病(Alternaria brown spot, ABS)是部分重要橘,以及这些橘和柚或橘和橙杂交柑橘上的重要病害,引起落叶、落果、枯梢,带病果实无法鲜销,常给感病的柑橘品种生产带来巨大困难。柑橘褐斑病的病原为交链格孢菌橘致病型(A. alternata pathotype tangerine,也称A. alternata pv. citri),已有的研究发现该病原菌能够产生寄主选择性ACT毒素,而该毒素是病菌致病所必需的；同时还发现活性氧解毒系统在病菌致病中也有重要的作用。然而,目前对柑橘褐斑病菌毒素的合成和调控过程以及抗氧化调控网络仍缺乏深入的认识,对该病菌的基础代谢过程,如生长和繁殖,对环境的适应以及次生代谢物产生等方面的研究也很少。深入研究柑橘褐斑病菌的生长、发育、繁殖、适应、次生代谢等基础生物学以及致病机理可为探索全新病害防治途径,改善现有防治策略提供新的思路,而一个完整的基因组信息是开展相关研究的基础。因此,我们对一个来自浙江瓯柑的柑橘褐斑病菌菌株Z7进行了全基因组测序,并与已知其他链格孢菌的基因组序列进行了比较,同时还分析了H202处理后的转录组变化,得到以下结果：1.比较基因组学研究揭示了柑橘褐斑病菌橘致病型的特异基因柑橘褐斑病菌Z7菌株基因组包含161个contigs,总长34.41Mb,平均G+C含量为51.0%。Z7基因组共编码12062个基因和115个tRNA,平均基因长度1726bp,序列重复率为0.55%。通过不同致病型交链格孢菌株直系同源基因的分类与比较,得到10个橘致病型特有的基因。这些基因成簇聚集在基因组上,后续分析认为它们是合成ACT毒素的关键组分,决定了柑橘致病型的分化。基因组水平上构建的系统进化树与Lawrence等提出的链格孢属下划分4个组的观点相吻合,为链格孢属真菌新分类系统提供了强有力的支撑。交链格孢菌橘致病型基因组中发现了18个次生代谢基因簇,其中柑橘专化性相关的ACT毒素基因簇长91.2kb,包括25个基因,大部分基因在基因组中都有2-3个拷贝,推测在进化过程中这些基因发生了复制,也暗示Z7具有较强的产生ACT毒素的能力。柑橘褐斑病菌含有较多的细胞壁降解酶,这与它们死体营养的生活方式相一致。2.比较基因组揭示柑橘褐斑病菌非必需染色体起源于链格孢菌的祖先我们用比较基因组的方法,获得了Z7总长1.88Mb的非必需染色体(Conditionally Dispensable Chromosome, CDC)序列。CDC和EC基因组的组成结构具有明显的不同,CDC的平均G+C含量是47.7%,序列重复率为1.23%；Z7CDC编码525个蛋白,不含有tRNA。利用GO数据库分析发现CDC上的基因主要富集在‘细胞代谢过程’、‘初级代谢过程’、‘氧化还原反应’和‘大分子代谢过程’等生物学过程。蛋白家族分析表明CDC上含有13个碳水化合物酶,29个分泌蛋白,3个激酶,21个转录因子,25个转运蛋白和13个细胞色素P450单加氧酶。密码子适应性指数(CAI)分析表明EC和CDC基因的密码子偏好性明显不同,暗示CDC的进化历史可能与EC不同。通过Ka/Ks分析发现,CDC上的基因都受到强烈的纯化选择。直系同源聚类发现接近77%的CDC基因的同源基因至少在5个其他链格孢菌种中出现,通过比较由24个链格孢菌属蛋白和29个其他真菌属的蛋白组成的两个数据库,超过95%的CDC基因都与链格孢菌数据库具有较高的相似性,表明CDC上绝大多数基因来自于链格孢属真菌的祖先。3.线粒体比较基因组揭示柑橘褐斑病菌与其他种属线粒体的保守基因在排布上显示巨大差异柑橘褐斑病菌线粒体基因组大小50,625bp,平均A+T含量为70.8%,含有13个标准的蛋白基因,2个核糖体大小亚基和31个tRNA,线粒体基因组编码效率为63.7%,整体表现出偏好使用富含A/T的密码子。腔菌目(Pleosporales)三个菌株线粒体基因组的基因较为保守,但基因的排布则表现出巨大的差异,暗示它们进化历史不同。用线粒体蛋白构建的不同物种系统进化树与核基因组构建的进化树-致,说明虽然线粒体基因相对基因组基因进化速度较快,但总体上与物种进化趋势吻合。不同真菌线粒体内基因组内含子及基因间区存在多样性,是造成线粒体大小差异的重要原因。4.转录组分析揭示谷胱甘肽系统、过氧化物酶和转运蛋白等基因家族在H202胁迫适应中发挥重要作用通过对柑橘褐斑病菌在H202处理30min后其转录组表达变化分析,发现1108个上调表达基因和498个下调表达基因。差异表达的基因主要富集在细胞代谢、氧化还原和细胞转运等生物过程。谷胱甘肽系统、硫氧还蛋白、过氧化氢酶、半胱氨酸过氧化物氧化还原酶等可能是该病菌清除H202的主要成员。此外,我们还发现转运蛋白、激酶家族、转录因子、细胞色素P450、泛素和热激蛋白等在柑橘褐斑病菌H202胁迫适应中发挥重要作用。在非必需染色体上也有29个基因受到H202的明显诱导,其中包括ACT毒素合成的关键基因聚酮合成酶CDCn|11750。二、柑橘绿霉病菌产孢中心调控途径和高渗甘油途径的功能基因研究柑橘绿霉病(Penicillium digitatum)是柑橘贮藏、运输和销售环节中的主要问题,在我国每年因绿霉病导致柑橘损失高达数百万吨。迄今,已有3个柑橘绿霉病菌菌株的全基因组公布,但对该病菌的生长发育、适应和致病等的分子机制了解甚少。形成大量的分生孢子是构成病害流行的基础,而抵抗适应高渗透势等逆境胁迫条件是病菌赖以寄生高糖柑橘果实的必要基础。为了解柑橘绿霉病菌产孢和对渗透势的适应机制,本文研究了该病菌的brlA、abA和wetA 3个产孢中心调控基因和双组份组氨酸激酶基因os2的生物学功能,取得如下结果：1. PdbrlA、PdabA和PdwetA调控柑橘绿霉病菌产孢的不同阶段病菌繁殖产生的大量无性孢子是绿霉病菌病赖以传播扩散的必要条件。brlA、 abaA和wetA是调节分生孢子形成的重要元件。柑橘绿霉病菌中PdbrlA敲除突变体完全丧失了形成分生孢子梗的能力；PdabaA敲除突变体虽能形成分生孢子梗,但所形成的分生孢子梗畸形,不具有产孢能力；PdwetA的缺失突变体能够形成正常的分生孢子梗,也可以产孢,但分生孢子的细胞壁明显疏松,加厚,分生孢子色素不沉积,分生孢子萌发延迟,病菌对渗透胁迫,去垢剂和热激反应的耐受性明显下降,但对H202的耐受性却变强。qRT-PCR结果表明绿霉菌中存在PdbrlA→PdabA→PdwetA级联调控模式,而且这种模式可能存在负反馈调节机制。基因表达谱分析结果表明：与野生型相比,缺失突变体中的401个基因下调表达,144个基因上调表达。Go富集表明下调表达的基因功能主要富集在细胞膜完整性,跨膜转运和碳水化合物活性等方面,上调的基因主要参与细胞膜转运的过程。KEGG分析预测PdbrlA与淀粉和蔗糖代谢途径有关。根据烟曲霉和构巢曲霉中产孢相关基因的报道,我们在绿霉菌中找到了39个与产孢相关的同源基因。其中,12个基因(abr1、alb1、arp1、arp2、ayg1、aspf4、rodA、rodB、ppoC、axl2、 abaA和wetA)在PdbrlA中表达明显下调,2个基因(flbA和flbB)表达明显上升,12个表达下调的基因启动子区都具有brlA和abaA的转录结合位点。2.柑橘绿霉病菌通过Pdos2正调控甘油含量、负调控甾醇含量适应高盐环境高渗甘油途径在真核生物体内广泛存在,对机体适应环境变化具有极其重要的作用。Os2是该途径的一个重要激酶,柑橘绿霉病菌△PdoS2突变体对NaCl渗透压和细胞壁干扰制剂刚果红和十二烷基苯磺酸钠的敏感性显著上升,对氟咯菌腈和异菌脲两种杀菌剂的抗性也有部分提高,表明Pdos2参与了高渗透胁迫适应、细胞壁完整性和药剂抗性等生命过程。然而突变体对由H202引起的氧化压的敏感性并没有明显改变。△Pdos2突变体在接种4天后引起的病斑大小相比野生型减少了约25%,表明Pdos2对维持柑橘绿霉病菌的致病性起到部分作用。0.7M NaCl处理后,野生型菌丝体内甘油的含量明显提高而麦角甾醇的含量却显著降低。△PdoS2突变体菌丝内的甘油含量仅有轻微地上升,而麦角甾醇的含量保持与野生型相同的状态,表明Pdos2参与调节的渗透适应是与它对甘油合成的正调控和麦角甾醇合成的负调控作用有关。Pdos2基因能够直接或者间接负调控甾醇合成途径关键基因Pderg11C、Pderg1、Pderg3A/B和Pderg25等的表达。