论文部分内容阅读
目的①建立一种体外留置并肝靶向性给药途径的大鼠动物插管的改良模型；②构建启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的急性肝损伤动物模型；③比较丹参注射液与TGF-β1 siRNA经肝动脉插管及尾静脉两种给药途径,抗实验性肝损伤及对肝组织中TGF-β/ Smad信号传导通路的干预效果。方法(1)大鼠肝动脉插管并体外留置模型改进型的建立：对Lindell肝动脉插管法进行改进,在10倍手术显微镜下,采用特制内径0.5mm导管(由硬膜外麻醉导管加工而成)经胃十二指肠动脉剪口处插入动脉血管内,逆行到达肝固有动脉开口处后留置导管并固定；(2)肝动脉插管留置及假手术5天后的大鼠急性肝损伤模型,在随后的第1天和第5天,分别予25%四氯化碳花生油溶液6ml／kg体重,腹腔注射,自由饮用水,进食普通颗粒饲料,造成急性肝损伤,第二次四氯化碳48h后处死所有动物；(3)30只模型鼠随机分为5组,每组6只,分别为模型对照(M)组,丹参注射液肝动脉插管给药组(A组),丹参注射液尾静脉给药组(B组),TGF-β1 siRNA质粒肝动脉插管给药组(C组),TGF-β1 siRNA质粒尾静脉给药组(D组),另加一组空白对照(N)组6只,没有经造模处理。A组与B组动物于已经插管留置5天后,分别经肝动脉插管及尾静脉途径导入丹参注射液治疗,丹参注射液为2ml／次／天,连续7天；C组与D组动物分别经肝动脉插管及尾静脉途径给药,在第1-4,6,7天予生理盐水注射2ml／次／天,第5天予抗TGF-β1 siRNA50μg治疗,M组予腹腔注射生理盐水2ml／次／天,连续7天、N组不做任何药物治疗,所有大鼠在第二次四氯化碳48小时后处死。(4)各实验组大鼠处死后检测：血清指标ALT、AST、HA;肝组织HE染色病理检测；PT-PCR技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad、PCNA和TGF-αmRNA表达；免疫组化技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad、PCNA和TGF-α蛋白的表达。结果(1)20只大鼠在构建肝动脉插管并体外留置模型实验中,术中2只因胃十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管；1只手术后死亡,成功者17只,成功率为85%。(2)急性肝损伤大鼠肝组织中TGF-β/Smad信号传导通路的启动实验中,模型组及肝动脉插管组与空白对照组比较：在血清肝功能指标ALT、AST及肝纤维化指标HA上明显上升(P<0.01)；通过肝组织HE染色病理观测,肝细胞出现明显炎症、变性、坏死,纤维组织增生等现象；PT-PCR检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad mRNA表达显著增强(P<0.01)；免疫组化检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad蛋白的表达增强(P<0.05)；而模型组与肝动脉插管组比较,在以上指标中差异不明显,无统计学意义(P>0.05)；以上表明,通过插管留置或假手术,加上四氯化碳急性损伤,均能成功启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路。(3)通过与模型组的比较：四个治疗组均能有效干预大鼠肝组织TGF-β/Smad信号传导通路,起到抗肝损伤、促进肝细胞再生及抑制肝纤维化的效果；在血清ALT、AST指标上,同一途径给药的两组动物比较,A组优于C组、B组优于D组(P<0.05)；而在血清HA指标上,差异无统计学意义(P>0.05)；运用PT-PCR及免疫组化技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、Smad mRNA及蛋白表达, A组与C组、B组与D组比较无明显差异(P>0.05)；但在PCNA、TGF-α以上指标上,A组优于C组、B组优于D组(P<0.05)；在TGF-β1指标上,则是C组优于A组、D组优于B组(P<0.05)；同一药物的不同途径组间的比较,在以上各个指标上,均肝动脉插管给药组优于尾静脉给药组(P<0.05)。结论①大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型具有创建技术方法简单、肝损伤性小、成功率高的特点；②致急性肝损伤,启动大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的动物模型能明显观察到肝纤维化过程中关键环节TGF-β／Smad信号传导通路的激活。该模型在评价抗肝纤维化药物及方法时具有耗时少、有效和经济的特点,值得进一步研究；③丹参注射液与TGF-β1 siRNA比较,在干预TGF-β／Smad信号传导通路及抗肝纤维化上疗效相当,但在抗肝损伤促进肝细胞再生方面,丹参注射液效果更好；④经肝动脉插管途径给药,相对于尾静脉途径,药效更好。