DEAD/H box蛋白家族是最大的RNA解旋酶蛋白家族,在所有真核细胞和许多细菌以及古生菌中存在,具有高度保守性。家族成员共有多个保守序列,其中之一为Asp-Glu-Ala-Asp/His（DEAD/H）序列。作为RNA解旋酶,DEAD/H box蛋白具有解旋RNA的经典功能,利用ATP/NTP的水解进而改变RNA-蛋白复合物的构象,从而参与从转录到降解等一系列的RNA代谢活动。它们的功能并不仅限于对RNA分子的修饰,多项研究表明,部分DEAD/H box蛋白如DHX9,DDX59和DDX5也参与到DNA的代谢。DEAD/H box蛋白在基因表达过程中起到重要作用,它们的失调会引起多种人类疾病。DHX33是DEAD/H box家族的一员。研究表明,DHX33通过参与多种RNA和DNA活动,调控细胞生长、增殖、迁移、凋亡等多种细胞活动。此外,DHX33还在先天免疫中发挥作用。DHX33作为重要的细胞周期调节因子,它的过表达被证实与多种癌症发生发展关联,如肺癌,乳腺癌,结肠癌等。关于DHX33的研究主要集中在DHX33的功能以及其在细胞活动中的调控作用,而针对DHX33的上游调控研究较少。课题组先前研究发现,在细胞周期的不同阶段,DHX33的蛋白水平出现波动,且变化趋势与其m RNA水平上的变化并不相符。通过使用氯化锂（Li Cl）对GSK-3β进行抑制,发现在结肠癌细胞中GSK-3β对DHX33的表达具有潜在调控作用,且是非转录调控,推测GSK-3β可能参与调控DHX33蛋白的稳定性。为了探讨GSK-3β对DHX33表达的潜在调控作用,本研究选用氯化锂在细胞内对GSK-3β进行抑制处理。氯化锂通过增强GSK-3β的抑制性p GSK-3β（S9）进而达到抑制GSK-3β活性的目的,使经典Wnt信号通路中的β-catenin产生累积,最终激活下游基因的转录,是经典Wnt信号通路的激活剂。课题采用高浓度氯化锂（10m M）对人结肠癌细胞HCT116分别处理4h,8h,12h。细胞样品在指定时间被收集并裂解,用以提取m RNA和蛋白质。蛋白质印迹法（Western blot）被用于检测DHX33、S9磷酸化GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量。实时定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）被用于检测DHX33和β-catenin的m RNA水平。Western blot实验结果表明,高浓度氯化锂（10m M）短时间（4h）的处理引起细胞内p GSK-3β（S9）蛋白水平的上调,说明GSK-3β功能被抑制,与此同时DHX33和β-catenin的蛋白表达量增加。在延长处理时间（8h）时,实验现象更为明显,说明GSK-3β对DHX33的表达具有潜在的调控作用。但在高浓度氯化锂（10m M）长时间（12h）的处理下,细胞内p GSK-3β（S9）的蛋白水平有轻微下调,同时减少的还有DHX33的蛋白表达量,β-catenin的蛋白表达量也不再增加。这可能是由于氯化锂的过度处理对细胞造成了副作用。RT-q PCR实验结果表明DHX33的m RNA水平变化趋势与其蛋白水平变化趋势不相符,尤其在高浓度氯化锂短时间处理的条件下。同样不相符的还有β-catenin的m RNA水平和蛋白水平二者的变化趋势。由此推测,GSK-3β对DHX33的调控作用发生在DHX33的后转录阶段,其中包括蛋白稳定性和蛋白翻译。为分析调控是否发生在蛋白稳定性水平,本研究使用蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）处理人结肠癌细胞系HCT116细胞4h,并以DMSO处理细胞作为阴性对照。在指定时间点收获细胞样品并进行Western blot分析。实验结果表明,细胞经过10μM MG132与10m M氯化锂处理后,细胞内DHX33和β-catenin蛋白表达水平的变化趋势相似,都出现上调。已知GSK-3β对β-catenin蛋白稳定性的调控作用,说明GSK-3β很可能也通过促进DHX33蛋白降解进行调控。在经典Wnt/β-catenin信号通路中,GSK-3β通过蛋白间的相互作用对β-catenin的蛋白降解进行调控,由此假设GSK-3β对DHX33的调控也是通过蛋白-蛋白相互作用。为了验证此假设,本课题在两种人结肠癌细胞系HCT116、LOVO和两种人肺癌细胞系H1975、H1299中采用免疫共沉淀法（Co-immunoprecipitation）分析DHX33与GSK-3β二者的结合。通过对抗原-抗体复合物进行免疫印迹法检测,在多种细胞系中均发现DHX33蛋白复合物中含有GSK-3β,说明在细胞内GSK-3β与DHX33存在蛋白-蛋白相互作用。进一步地,本研究从GSK-3β在细胞内的敲低和过表达两个方面来设计实验。首先设计出两种不同的靶向GSK-3β的sh RNA用以敲低细胞内源GSK-3β。实验结果表明,当GSK-3β在细胞内被敲低时,DHX33的蛋白表达量增加。当细胞经过MG132处理后,DHX33蛋白表达水平与对照组相比有所升高。从过表达的角度验证,课题组购买了三种类型的GSK-3β过表达质粒,分别是野生型（wild type,WT）、持续激活型（constitutively active,CA）和激酶失活型（kinase dead,KD）,将这三种质粒瞬时转染到HCT116细胞内。在指定时间收集细胞样品并裂解,通过Western blot分析细胞内GSK-3β蛋白、DHX33蛋白表达水平的变化。结果表明,在GSK-3β过表达的情况下,DHX33的蛋白表达水平呈现下调趋势。同时,不同激酶活性的GSK-3β的过表达引起DHX33蛋白表达水平下调程度不同,说明GSK-3β的激酶活力参与调控DHX33。课题还使用另一种GSK-3β抑制剂CT99021对HCT116细胞进行处理以加强结论。CT99021的浓度梯度设定为:0,0.5μM,1μM,2μM,处理HCT116细胞12h。该实验设定两组,一组只用CT99021处理,另一组加入CT99021的同时加入10μM MG132。细胞样品在指定时间被收集并进行Western blot实验,分析细胞内DHX33和β-catenin蛋白表达量的变化。结果表明,在对照组中,随着CT99021浓度的升高,DHX33和β-catenin的蛋白表达量有明显的增加。而在MG132处理组中,当CT99021浓度较低时（0,0.5μM）,MG132的处理使DHX33和β-catenin蛋白表达水平上调;在CT99021浓度更高的情况下,两种药物的同时处理可能对细胞造成了一定的副作用,引起DHX33和β-catenin蛋白表达量下降。上述一系列实验的结果都表明GSK-3β对DHX33的蛋白表达有调控作用。CT99021作为GSK-3β抑制剂的原理是竞争性结合GSK-3β的ATP结合位点,从而抑制GSK-3β作为激酶的磷酸化能力,推测GSK-3β对DHX33蛋白调控源于GSK-3β对DHX33蛋白的直接磷酸化,进而诱导了DHX33蛋白的降解。为进一步分析GSK-3β对DHX33蛋白的调控是否与DHX33的蛋白降解有关,本研究使用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX）（100ng/μl）对GSK-3β敲低的HCT116细胞进行处理,时间梯度为0,2h,4h,6h,8h,10h,12h。在指定时间收集细胞并对样品进行Western blot分析后,观察到在GSK-3β敲低的情况下,DHX33蛋白的半衰期与对照组相比延长。说明GSK-3β通过调控DHX33蛋白降解从而影响DHX33的蛋白稳态水平。为了验证GSK-3β通过磷酸化作用调控DHX33蛋白降解的假设,本研究采用质谱法（MS）以检测DHX33蛋白被GSK-3β激酶磷酸化的潜在位点。通过体外的激酶反应体系,使用GSK-3β重组蛋白和DHX33重组蛋白共培育来进行体外磷酸化反应,然后对反应产物进行MS-MS检测。实验结果表明,在与人GSK-3β重组蛋白进行体外磷酸化反应后,鼠DHX33重组蛋白在T43和T482两个位点出现磷酸化,说明在体外GSK-3β蛋白对DHX33蛋白有磷酸化作用。在两个磷酸化位点中,鼠DHX33蛋白T482位点对应人DHX33蛋白T490位点,鼠DHX33蛋白T43位点在人DHX33蛋白上无对应位点,不是保守性位点。因此本研究继续选取并围绕T482位点展开后续实验。为了分析GSK-3β对DHX33蛋白的磷酸化与DHX33的蛋白降解相关,本研究继续设计针对DHX33的T482位点进行苏氨酸/天冬氨酸（T/D）突变和苏氨酸/丙氨酸（T/A）突变,以获得突变后的DHX33-T482D和DHX33-T482A质粒。T482D突变模拟了T482的磷酸化,而T482A质粒模拟了T482的非磷酸化。然后,分别用质粒p LVX-DHX33-WT、p LVX-DHX33-T482D和p LVX-DHX33-T482A质粒对HCT116细胞进行瞬时转染,48小时候后收获细胞样品并用Western blot分析FLAG-DHX33的稳态蛋白表达量。实验结果表明,T482位点的突变引起了DHX33蛋白降解程度的改变。分别用三种质粒转染细胞36小时后,用100ng/μl放线菌酮（Cycloheximide,CHX）进行时间梯度处理,时间梯度为0,4h,8h,12h。指定时间收获细胞样品并进行免疫印迹分析。实验结果表明DHX33-T482D突变导致DHX33蛋白半衰期明显缩短。本研究中,仍然存在许多问题丞待解决。比如需要建立GSK-3β的稳定过表达体系。为探究GSK-3β对DHX33蛋白磷酸化是否会如预期进一步介导DHX33的泛素化,并最终引起DHX33的降解,课题首先需要分析内源DHX33在不同条件下的泛素化。比如,在GSK-3β被抑制和过表达的情况下,分别对细胞进行免疫沉淀实验,分析DHX33的泛素化是否受到GSK-3β的调控。在对DHX33的T482位点进行点突变的前提下,将野生型、T482A突变型以及T482D突变型DHX33质粒分别转染进入细胞内,并对细胞进行免疫沉淀实验分析,以验证DHX33蛋白的泛素化是否与其磷酸化状态有关。综上,本课题创造性地提出了DHX33上游的一种调控机制,即揭示了GSK-3β对DHX33的调控作用并首次探索了其中的分子机制。本课题的延展意义可能为理解结肠癌的发生及未来的癌症治疗带来新的理解和思路。