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目的PM2.5经呼吸道可直接进入支气管和肺泡深处并在肺泡中沉积。当达到一定量后,能够引起上呼吸道细胞和肺泡细胞发生炎症反应和氧化应激反应,能够通过调控基因的表达来调控蛋白质的合成,从而诱导细胞的凋亡和DNA损伤。本研究旨在探讨PM2.5对人支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cells,简称HBE细胞）细胞凋亡、DNA损伤和致突变的分子机制,展开一系列研究,为进一步研究PM2.5对人体毒性提供科学依据,对探讨大气细颗粒物PM2.5致癌致突变的毒理学作用机制具有重要意义。方法1、用低剂量10μg/mL和高剂量50μg/mL的PM2.5水溶液对HBE细胞染毒,用未染毒的细胞作为空白照组,同时设立10μM的Cr6+染毒的HBE细胞为阳性对照组,应用实时荧光定量PCR（q-PCR）检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA表达水平变化,Western blot检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2的蛋白质表达水平变化。2、用p38MAPK抑制剂SB203580、ERK MAPK抑制剂PD98059和PCK抑制剂CHE提前处理HBE细胞30 min,再用剂量为50μg/L的PM2.5水溶液染毒HBE细胞24 h,以相同浓度和时间PM2.5水溶液单纯染毒HBE细胞作为染毒对照组,用未染毒的细胞作为空白对照组,同时设置抑制剂对照组（即单纯的抑制剂处理组）;检测凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2在基因和蛋白表达水平的变化,使用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测凋亡基因表达水平的变化,Western blot检测检测凋亡基因的蛋白质表达变化。3、用浓度为10μg/mL和50μg/mL的PM2.5水溶液对HBE细胞染毒,用未染毒的细胞作为空白照组,同时设立10μM的Cr6+染毒的HBE细胞为阳性对照组,10μM的Cr6+为阳性对照组;检测DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1在基因和蛋白表达水平的变化;实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测上述DNA损伤基因的表达水平变化,Western blot检测检测DNA损伤修复基因的蛋白质表达变化;使用梯度浓度PM2.5（0、8、20、50μg/mL）水溶液染毒HBE细胞,单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤情况。4、应用5种组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌,通过平板渗入法对已处理好的PM2.5样品进行污染物致突变性检测,即标准Ames试验。实验设立4个PM2.5水溶物染毒剂量组分别为:40、100、200和400μg/皿、同时设立1个阴性对照组和1个阳性对照组,每种细菌均设立加S9和不加S9两种试验组。5、基因芯片实验:用浓度为50μg/mL的PM2.5水溶物染毒HBE细胞24 h,用未染毒的细胞作为空白对照组,设立3组平行样品提取的RNA样品完成荧光标记与纯化后与芯片杂交,用Rosetta Resolver?System（Rosetta Biosoftware）进行数据前处理与统计计算,分析得到差异表达基因。将数据经过cluster Profiler软件进行主成分和聚类分析、Pathway及GO分析,初步探讨PM2.5染毒前后HBE细胞中基因的差异表达;通过String蛋白互作数据库分析差异表达基因的蛋白互作关系,筛选出节点数最多的为核心蛋白;最终选出与PM2.5致HBE细胞凋亡,癌变和DNA损伤相关的核心基因,使用q-PCR技术进行基因验证。结果1、PM2.5染毒HBE细胞后,与对照组比较,促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax的相对表达水平均有升高,抑凋亡基因Bcl-2的相对表达水平有明显下降。Western blot检测结果显示,促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和抑凋亡基因Bcl-2的蛋白相对表达水平的结果与q-PCR结果趋势一致。2、PM2.5染毒前加p38抑制剂（SB203580）、ERK抑制剂（PD98059）和PKC抑制剂（CHE）处理,SB203580+50μg/mL PM2.5组与单纯50μg/mL PM2.5染毒组比较,促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax的相对表达水平均有下降,抑凋亡基因Bcl-2对的相对表达水平有明显上升;Western blot检测的促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和抑凋亡基因Bcl-2的蛋白相对表达水平的结果与q-PCR结果基本一致。3、用10μg/mL和50μg/mL的PM2.5水溶液以及阳性对照Cr6+染毒HBE细胞后,与对照组比较,DNA损伤修复基因hOGG1和hMTH1的相对表达水平均有升高,Western blot结果显示,与对照组比较,DNA损伤修复基因hOGG1和hMTH1的蛋白相对表达水平与基因相对表达水平趋势一致。单细胞凝胶电泳检测8、20和50μg/mL染PM2.5组的尾部DNA含量、尾长、尾距和olive尾距比对照组明显增加,且各剂量组间存在剂量-效应关系。4、Ames结果显示,在PM2.5浓度为40μg/皿和200μg/皿时,加S9与不加S9,TA97菌株的菌落回变数比较,差异有统计学意义（p<0.01）;在PM2.5浓度为400μg/皿时,加S9与不加S9,TA98和TA100的菌落回变数相比较,差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。5、PM2.5水溶液染毒HBE细胞,应用基因芯片技术检测,筛选出245个差异表达基因,其中表达上调基因27个,表达下调基因218个。根据预设的筛选条件,经过进一步分析,筛选出排名前十的上调和下调的核心基因。排名前10的差异基因GO（Gene Ontolog）功能注释富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在跨膜受体活性、受体活性、细胞信号传导、细胞分子传导等分子功能。同时富集于离子跨膜转运、细胞对脂多糖无机离子跨膜转运、细胞营养转运等生物过程;排名前10的差异表达基因的Pathway及GO富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在涉及肿瘤细胞迁移、胆汁代谢相关、神经活性、遗传毒性等方面的7个核心通路;蛋白互作用网络图筛选出交互作用最多的5个蛋白,最终筛选出WFDC1、SFRP1和PHACTR1为核心基因,q-PCR验证结果与基因芯片检测出3个核心基因表达趋势一致。结论1、结果显示PM2.5水溶液染毒可引起人支气管上皮细胞（HBE）的凋亡。2、提示p38MAPK、ERK MAPK、PKC信号通路可有效抑制PM2.5染毒对HBE细胞的致凋亡作用。3、PM2.5水溶液对HBE细胞的DNA损伤有影响。4、Ames实验结果结果表明PM2.5具有直接和间接致基因突变作用。5、基因芯片结果显示,PM2.5使HBE细胞通过部分通路、生物学功能导致与其相关基因的差异表达,且从差异表达的基因谱中筛选的核心基因,可为本课题进一步研究PM2.5对HBE细胞凋亡、DNA损伤和致其突变的分子机制提供重要线索。