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目的:Rad6B是一种E2泛素交联酶(E2),我们的前期研究表明,Rad6B的缺失会导致DNA损伤修复的缺陷,神经元更容易衰老。最近我们发现Rad6B缺失会导致小鼠皮肤衰老,但其在皮肤组织中的作用及其机制仍不清楚。本研究探讨随着年龄的增长Rad6B的缺失对皮肤组织中线粒体功能的影响及是否导致皮肤易于衰老。发掘Rad6B发挥作用潜在的靶基因,为皮肤衰老病理和治疗提供依据。方法:通过配对繁殖获取基因敲除小鼠和同窝野生对照小鼠。至1月龄、3月龄、12月龄分组。用小鼠皮肤取材和包埋技术进行组织切片,HE、Masson、Oil red-O染色观察皮肤组织的厚度、胶原纤维的含量、以及皮下脂滴数量的变化;通过免疫组化,PCNA、PGC-1α分别标记皮肤组织的增殖和线粒体生物合成情况;qRT-PCR法筛选与皮肤增殖和代谢相关的因子;Western blotting法检测线粒体呼吸链上五种复合体、线粒体融合和分裂及衰老相关蛋白的表达并探索Rad6B的底物;ATP含量检测试剂盒检测小鼠皮肤组织的ATP含量;提取皮肤原代成纤维细胞,通过线粒体红色荧光探针和免疫荧光ND1、COX4染色观察其线粒体的膜电位和线粒体电子传递链上复合体Ⅰ、Ⅳ在线粒体上的共定位;以及DCFH-DA荧光探针观察细胞内活性氧ROS产生的水平;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;CCK-8法及RTCA测定皮肤原代成纤维细胞的活力和增殖;透射电子显微镜检测细胞内线粒体状态;用海马XF24细胞外通量分析仪检测细胞耗氧量(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。结果:1、HE、Masson、油红O染色发现WT和KO小鼠的皮肤表型随着年龄的增长差异明显,表明敲除Rad6B可能会引起小鼠皮肤生理结构的改变;2、通过Western Blot、qRT-PCR、免疫组化实验,检测到Rad6B的缺失影响了皮肤的增殖和代谢,在各组中出现了不同的变化,尤其在1月龄和12月龄的小鼠群体中差异尤为明显;3、通过免疫印迹观察Rad6B缺失后降低了线粒体复合体I和IV的活性,线粒体动力学在老龄时下降,因此损害了线粒体功能。4、Rad6B敲除会导致皮肤原代成纤维细胞的线粒体膜电位和结构、细胞活力和增殖、ROS水平异常和细胞衰老;5、随着年龄的增长,Rad6B敲除导致皮肤原代成纤维细胞的能量代谢改变,这可能是通过重新编程代谢网络,从而弥补了老龄KO小鼠皮肤原代成纤维细胞ATP生成的缺乏。结论:总之,这些发现表明随着年龄的增长Rad6B的缺失会导致小鼠皮肤胶原纤维含量降低,皮肤细胞增殖减少,线粒体复合体活性降低,线粒体功能下降,以及线粒体能量代谢紊乱,加速小鼠的皮肤衰老。因此,Rad6B可能对维持正常的组织代谢和线粒体功能至关重要。