目的高血压是充血性心衰、中风、终末期肾病的重要危险因子。据WHO统计,全世界的成年人群约有15-37%患有高血压病,而60岁以上某些人群,高血压的发病率可达50%。预计到2025年,全世界高血压的发病人数将飚升至15亿6千万人。但令人遗憾的是,只有接近三分之一的患者降压治疗达标。主要的原因在于高血压病是一种终生性疾病,而目前所有降压药的半衰期相对较短,有效作用时间均不超过24小时,故必须每天服药,病人不易坚持。此外由于药物的非特异性和副作用,也使高血压的治疗难以达到预期目标。因此寻找一种长期有效且通过调节体内基因表达而控制高血压的方法即基因治疗一直是医学家们努力的方向和目标。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是近年来发展起来的基因阻断技术,该技术通过双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）的介导,被属于RNaseⅢ家族的Dicer内切酶切割产生大量的小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNA）,并特异性降解与之序列同源的mRNA,而导致转录后水平的基因沉默。研究表明当siRNA呈短发央状RNA（shorthairpin RNA,shRNA）时,其基因沉默的效应更强。本实验即利用先进的RNA干扰技术,选择与高血压发生发展密切相关的肾素一血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）中的血管紧张素转换酶（Angiotensin-converting enzyme,ACE）和血管紧张素Ⅱ1型受体（AngiotensinⅡtype 1 receptor,AT₁R）为靶点,构建ACE和AT₁R串联的shRNA的表达载体,分别在体外和体内实验中运用该技术抑制ACE和AT₁R mRNA和蛋白质的表达,从而探索联合和单基因沉默在高血压治疗中的应用前景。方法1.构建靶向抑制大鼠ACE和AT₁R基因的shRNA真核表达载体:首先在GeneBank上选取大鼠ACE和AT₁R mRNA序列,根据siRNA设计原则,各设计两条靶序列,并进行BLAST验证,我们课题组经大量前期试验筛选出基因沉默作用较强的针对大鼠ACEmRNA和AT₁RmRNA的两条siRNA序列;利用分子克隆技术,在体外合成编码ACE-shRNA和AT₁R-shRNA的寡核苷酸序列单链,退火形成双链之后,利用限制性内切酶技术将其分别与PEGFP6-1和Pgenesil-hH1质粒载体连接,成功的构建了质粒pACE-shRNA、pAT₁R-shRNA真核表达载体;再次利用限制性内切酶技术将目的基因片段ACE与目的基因片段AT₁R连接,成功的构建了携带hU6和hH1启动子的重组串联质粒pACE-AT₁R-shRNA真核表达载体。2.质粒pACE-AT₁R-shRNA转染大鼠血管内皮细胞条件的优化:①植块法原代培养大鼠血管内皮细胞:将SD大鼠（体重120-150g）用颈椎脱臼处死,无菌状态下取出其胸、腹主动脉,剪成约1mm×1mm的血管片,内膜面壁贴于培养瓶内,在含有胎牛血清的DMEM培养液中进行大鼠动脉血管内皮细胞的原代和传代培养。倒置相差显微镜下观察内皮细胞的形态和生长特性,并进行血管内皮细胞中Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor,vWF）的检测鉴定。②用不同比例的质粒pACE-AT₁R-shRNA与脂质体转染剂METAFECTENE2000的复合物转染大鼠血管内皮细胞。因质粒中含绿色荧光蛋白的报告基因,故转染后48小时可在荧光显微镜下观察绿色荧光表达并计算转染效率,同时用MTT法检测细胞存活率,寻求转染效率较高且细胞毒性较低的pACE-AT,R-shRNA与METAFECTENE2000的最佳配比。3.质粒pACE-AT,R-shRNA抑制大鼠血管内皮细胞ACE和AT₁R表达的研究:用pACE-AT,R-shRNA与METAFECTENE2000的最佳配比复合物转染大鼠血管内皮细胞,分别于转染前及转染后的24h、48h、72h收集细胞,用RT-PCR及Western blot法检测ACE和AT₁RmRNA及相应功能蛋白的表达。大鼠血管内皮细胞分为五组:①空白对照组;②质粒对照组;③pACE-shRNA组:④pATiR-shPdqA组;⑤pACE-ATlR-shRNA组。4.构建靶向抑制大鼠ACE和AT₁R基因的shRNA重组腺病毒载体:利用AdMax腺病毒包装系统,自先期构建的pACE-AT,R-shRNA真核表达载体中酶切出ACE-AT₁R-shRNA,克隆入穿梭质粒pDC316中,然后将穿梭质粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6和腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的腺病毒载体Ad5-EGFP-ACE-AT,R-shRNA并扩增、纯化、鉴定。5.腺病毒介导的ACE-AT₁R-shRNA对自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensiverat,SHR）的治疗作用:自发性高血压大鼠随机分为五组:①空白对照组;②病毒对照组;③Ad5-EGFP-ACE-shRNA治疗组;④Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA治疗组;⑤Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA治疗组;⑥正常血压对照组。以上各组大鼠均注射两次,注射时间均为实验的第1天和第17天。实验期间做以下检测:①注射前后检测血压、心率的变化。②首次注射后第3天,取治疗组大鼠心、主动脉、肾脏、脑、肺组织,做冰冻切片,荧光显微镜下观察腺病毒载体吸收情况。③首次注射后第3天,心脏体外采血用ELISA法检测各组大鼠血浆中ACE和AngⅡ的含量,且用实时荧光定量PCR及Westernblot法检测心肌、脑、主动脉、肾脏组织中ACE和AT₁RmRNA及相应功能蛋白的差异表达。④实验结束后,取各组大鼠心、脑、主动脉、肾脏组织做光镜及电镜切片,并检测大鼠全心/体重、左心室/体重,及心肌羟脯氨酸、胶原蛋白的含量,以观察心肌重构的变化。同时采血检测肝肾功能。6.腺病毒介导的ACE-AT₁R-shRNA对自发性高血压大鼠的治疗作用机制:自发性高血压大鼠分组和治疗同前,实验期间做以下检测:①注射前后检测血压、心率的变化。②首次注射后第3天,取治疗组大鼠心、脑、肾脏组织,用ELISA法检测各组大鼠组织中ACE和AngⅡ的含量,并且用实时荧光定量PCR及Western blot法检测心、脑、主动脉、肾脏组织中ACE2和AT₂R mRNA及相应功能蛋白的差异表达。③首次注射后第3天,每组随机取6只大鼠,心脏体外采血.同时取心、脑、肾组织按照NO测试盒说明操作检测NO。结果1.经DNA测序和酶切鉴定,证明我们构建的靶向抑制大鼠ACE和AT₁R基因的shRNA真核表达载体一重组质粒pACE-AT₁R-shRNA无基因突变,符合实验要求。2.①植块培养3天倒置相差显微镜观察即可发现有内皮细胞从组织块周围移出,大约10天细胞开始融合成片,呈“铺路石样”。传代培养的细胞和原代培养形态相似,生长较快,4-5天可以融合成单层,传至3-4代时,细胞开始变性变形、脱落,不再继续生长。用免疫荧光法鉴定可见胞浆内有大量绿色荧光。②根据转染效率以及细胞生存率测定结果,筛选出质粒与转染试剂复合物的最佳配比为pACE-AT₁R-shRNA 1.0μg、METAFECTENE2000 4μl,此时转染效率为57.7%,细胞生存率为91.6%,优于其他条件时的转染效率并能保证较低的细胞毒性,故作为我们进一步实验的最佳选择。3.pACE-shRNA和pACE-AT₁R-shRNA组在转染后48小时细胞内ACEmRNA及相应蛋白表达均明显降低,pAT₁R-shRNA和pACE-AT₁R-shRNA组在转染后48小时AT₁RmRNA的表达明显降低,与空白对照组和质粒对照组相比均有统计学差异（P＜0.05）,72小时表达更低（P＜0.01）。实验中发现pACE-AT₁R-shRNA的抑制作用更强一些,可能为ACE和AT₁R双基因联合沉默的协同效应所致,而空白对照组与质粒对照组转染前后各时间点ACE和AT₁R mRNA及相应蛋白的表达无明显变化。4.经限制性内切酶、PCR检测和荧光显微镜观察,证实成功构建了能够表达ACE和AT₁R shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒。5.①干预前SHR各组之间尾动脉压差异无统计学意义（P＞0.05）,而SHR各组均与正常血压对照组有显著性差异（P＜0.05）。SHR治疗组于首次注射后第3天,尾动脉压分别下降（25.2+5.3）mmHg,（23.5+4.8）mmHg,（27.1+6.4）mmHg,与治疗前比较有统计学差异（P＜0.05）,降压作用可持续15天左右,最大降压幅度达24mmHg,22mmHg,26 mmHg,首次注射后约17天时血压开始回升;第2次注射后,尾动脉压再次明显下降（22+6）mmHg,（20+5）mmHg,（23+7）mmHg,降压作用可持续20天左右,最大降压幅度达23mmHg,22mmHg,23mmHg。而SHR空白对照组和病毒对照组尾动脉压持续升高,正常血压对照组尾动脉压无明显变化。②荧光显微镜下可见心肌、脑、主动脉、肾脏、肺组织的冰冻切片有大量绿色荧光表达,说明Ad5-EGFP-ACE-shRNA,Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA,Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA可被富含ACE和AT₁R的组织大量吸收。③SHR治疗组血浆ACE含量明显低于空白对照组与病毒对照组;SHR治疗组Ad5-EGFP-ACE-shRNA血浆AngⅡ显著低于SHR空白对照组和病毒对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,SHR治疗组Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA血浆AngⅡ明显升高与SHR空白对照组、SHR病毒对照组比较差异有统计学差异（P＜0.05）,SHR治疗组Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA血浆AngⅡ介于以上两个治疗组之间。SHR治疗组心、脑、主动脉、肾脏组织中AT₁R mRNA及相应蛋白表达较SHR空白对照和SHR病毒对照组明显降低（P＜0.05）,以Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA和Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA治疗组明显低于Ad5-EGFP-ACE-shRNA治疗组和正常血压对照组;Ad5-EGFP-ACE-shRNA、Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA治疗组和正常血压对照组ACE mRNA及相应蛋白表达较Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA治疗组、SHR空白对照和SHR病毒对照组明显降低（P＜0.05）④光镜切片显示治疗组心肌细胞肥大明显减轻,脑、肾和主动脉细胞病理改变明显减轻;电镜切片显示治疗组心肌细胞和肾脏超微结构明显改善。左心室/体重之比与心肌胶原蛋白含量:治疗组显著低于空白对照组与病毒对照组,但还未降到正常血压对照组水平。⑤整个实验期间,各组心率及肝肾功能均无明显变化。6.①SHR各治疗组心、脑、肾脏组织的ACE,AngⅡ显著低于SHR空白对照组和病毒对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,而与正常血压对照组无统计学差异（P＞0.05）。②SHR各治疗组血清和心、脑、肾脏组织NO显著高于SHR空白对照组和病毒对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,而与正常血压对照组无统计学差异（P＞0.05）。③SHR治疗组心、脑、主动脉、肾脏组织的ACE2 mRNA及相应蛋白表达均较SHR空白对照组、SHR病毒对照组显著升高,有统计学意义（P＜0.05）,而与正常血压对照组无统计学差异（P＞0.05）。SHR空白对照组、SHR病毒对照组和Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA组心、脑、。肾、主动脉组织AT₂R mRNA及相应蛋白表达较WKY组、Ad5-EGFP-ACE-shRNA治疗组,Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA治疗组明显升高,有统计学意义（P＜0.05）。其中单用Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA组心、脑、肾、主动脉组织AT₂RmRNA升高最明显。结论:1.成功构建了以大鼠ACE和AT₁R基因为靶位的真核表达载体pACE-AT₁R-shRNA。2.通过血管植块方法实现了大鼠动脉血管内皮细胞的原代培养并传代,细胞纯度在90%以上。经过优化转染条件,脂质体转染剂METAFECTENE2000可以将重组质粒pACE-AT₁R-shRNA高效转染入大鼠血管内皮细胞,并保证较低的细胞毒性。3.真核表达载体pACE-AT₁R-shRNA转染进大鼠血管内皮细胞后可以有效地实现对靶基因mRNA的降解,进而抑制相应功能蛋白的表达。4.成功构建了能够表达ACE-AT₁R-shRNA的重组腺病毒载体。5.腺病毒介导的Ad5-EGFP-ACE-shRNA,Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA,Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA注射入自发性高血压大鼠体内后,成功发挥了基因沉默作用,有效抑制了ACE和（或）AT₁RmRNA及相应功能蛋白的表达,起到了明显、持久的降压作用,并且显著改善了心肌重构,明显减轻了脑、肾脏、主动脉组织的病理改变,使心脏和肾脏超微结构明显改善,同时未发现明显的副作用。联合沉默组稍优于单基因沉默组,可能由ACE和AT₁R双基因联合沉默的协同效应所致。因此,运用RNA干扰技术进行降压治疗是一种非常具有潜力的新策略,本研究也为小剂量应用Ad5-ACE-AT₁R-shRNA联合基因沉默ACE和AT₁R治疗高血压提供了临床应用的前景。6.腺病毒介导的Ad5-EGFP-ACE-shRNA,Ad5-EGFP-AT₁R-shRNA,Ad5-EGFP-ACE-AT₁R-shRNA注射入自发性高血压大鼠体内后,使心、脑、肾脏局部组织中ACE、AngⅡ水平降低和NO水平升高,同时使得AT₂RmRNA/AT₁RmRNA和ACE2 mRNA表达显著升高,进而使相应功能蛋白的表达升高,阻断了ACE和ACE2两种羧肽酶表达的失衡,防止了高血压的靶器官损害;由此产生明显持久的降压作用。